一种pCasSA质粒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种pCasSA质粒及其应用。所述的pCasSA质粒，其序列为SEQ ID NO：1。本发明专利技术能够(1)高效并且快速地编辑各种金黄色葡萄球菌菌株的基因组，其中包括基因敲除、单碱基突变和基因插入；(2)能够对目标基因表达起到高效转录抑制作用。所述技术在金黄色葡萄球菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、金黄色葡萄球菌生理研究等方面具有广阔地应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种pCasSA质粒及其应用
本专利技术涉及一种pCasSA质粒及其应用。
技术介绍
金黄色葡萄球菌是一种极为重要的阳性人类病原细菌。它几乎能够感染人体的任何部位，既能引起较为轻微的皮肤表面感染，也能引起致命的严重感染，例如毒素休克综合症、坏死性肺炎、心内膜炎等。金黄色葡萄球菌强大的感染和致病能力主要归因于其分泌的细胞毒素以及细胞表面多种多样的多功能免疫操纵蛋白，包括聚集因子、纤粘蛋白结合蛋白、胶原蛋白结合蛋白等。这些表面蛋白通过与人体细胞直接作用，起到规避宿主免疫反应、生物膜形成、细菌定植等多方面利于感染的功能。近年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)等耐药性细菌的大规模流行，更加增加治疗金黄色葡萄球菌感染的难度，因此寻求新型药物靶标和开发新型小分子药物迫在眉睫。新型药物靶标的发现离不开基因组层面功能基因的筛选以及后续基因功能的确证。金黄色葡萄球菌中用于功能基因筛选的技术主要为基于转座子插入突变的方法。这种方法虽然能够在基因组层面实现基因功能的筛选，但筛选过程往往十分繁琐，并且需要大量的人力和物力。由于转座子插入位置的随机性，这种技术不能应用于限定的基因群，比如细胞表面蛋白功能的筛选。后续基因功能的确证离不开该基因敲除突变体的构建。金黄色葡萄球菌中用于突变体菌株的构建方法主要为经典的基于双交换同源重组的方法。由于这种方法存在操作繁琐，效率较低的问题，大大限制了高效的基因功能的研究。因此迫切需要开发金黄色葡萄球菌中高效的基因组编辑技术。CRISPR/Cas9是一种近年来开发出来的新型基因组编辑技术。它极具革新生命体中基因组修饰与突变技术的潜力。此技术最初来源于微生物先天性免疫系统，是微生物对抗噬菌体入侵的一种极为有效的方法。它主要是由一种核酸内切酶Cas9和一种介导RNAsgRNA所构成。Cas9核酸内切酶能够与sgRNA特异性结合，通过sgRNA与基因组DNA碱基互补配对靶向识别基因组并实现基因组DNA的双链断裂。结合基因重组酶(DNArecombinase)，此技术能够极为快速方便并且准确的靶向修饰与突变基因组的任何部分。伴随着大规模DNA微阵列合成技术的突破性发展，此技术能够在基因组层面或特定基因群实现大规模转录抑制和激活，大大提高了功能基因筛选的效率。CRISPR/Cas9基因组编辑技术已经在哺乳动物细胞以及一些模式生物，例如大肠杆菌、酵母等，实现了高效的基因组编辑，但还没有在金黄色葡萄球菌中实现基因组编辑。因此通过工程化和改造CRISPR/Cas9体系，使其能够适用于金黄色葡萄球菌中基因组编辑，将极大简化金黄色葡萄球菌的遗传学操作，还将提升功能性基因的筛选效率，为后续基因生物学功能研究，药物靶标发现，新型药物设计以及基因治疗打下基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种pCasSA质粒及其应用。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种pCasSA质粒，其序列为SEQIDNO：1。本专利技术还提供了上述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因敲除中的应用。优选地，所述的基因为agrA基因。本专利技术还提供了上述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的单碱基突变中的应用。优选地，所述的单碱基突变为agrA基因中94位的鸟嘌呤G突变成胸腺嘧啶T。本专利技术还提供了上述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因插入中的应用。优选地，金黄色葡萄球菌株的agrA基因作为插入位点，以红色荧光蛋白的rfp基因为插入基因。本专利技术还提供了上述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因转录抑制中的应用。优选地，所述的基因为agrA基因和/或sasE基因。优选地，所述的金黄色葡萄球菌株为金黄色葡萄球菌RN4220，Newman或USA300。本专利技术还提供了含有上述的pCasSA质粒的大肠杆菌DH10B菌株，其分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号为：CCTCCM2016773。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术涉及在金黄色葡萄球菌中基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术形成的pCasSA质粒以及相关应用。本专利技术的质粒能够(1)高效并且快速地编辑各种金黄色葡萄球菌菌株的基因组，其中包括基因敲除、单碱基突变和基因插入；(2)能够对目标基因表达起到高效转录抑制作用。所述技术在金黄色葡萄球菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、金黄色葡萄球菌生理研究等方面具有广阔地应用前景。含有pCasSA质粒的大肠杆菌DH10B菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2016.12.20，保藏号为：CCTCCM2016773。附图说明附图1：编辑质粒pCasSA图谱；BsaI位点：用于GoldenGateAssembly技术插入spacer片段；XbaI和XhoI位点：用于GibsonAssembly技术插入目标基因的上下游修复模板；cap1Apromoter：sgRNA表达的启动子；rpsLpromoter：Cas9蛋白基因表达的启动子；repF：金黄色葡萄球菌中温度敏感的质粒复制子，用于质粒消除；Cm：金黄色葡萄球菌中氯霉素抗性基因片段；KanR：大肠杆菌中卡那霉素抗性基因片段；ColE1：大肠杆菌中的质粒复制子。附图2：pCasSA在金黄色葡萄球菌各种菌株中实现高效基因组编辑；图A.采用pCasSA系统在金黄色葡萄球菌中进行基因敲除的示意图，和在Newman菌株中进行agrA基因敲除的PCR验证，溶血实验以及DNA测序结果。图B.采用pCasSA系统在金黄色葡萄球菌中进行基因单碱基突变的示意图，和在Newman菌株中进行agrA基因单碱基突变的溶血实验和DNA测序结果。图C.采用pCasSA系统在金黄色葡萄球菌中进行基因插入的示意图，和在Newman菌株中将rfp基因插入agrA基因位点的PCR验证和DNA测序结果。附图3：基于pCasSA开发的转录抑制体系实现金黄色葡萄球菌中目标基因的高效转录抑制。图A.在金黄色葡萄球菌中使用pCasSA系统对目标基因进行高效转录抑制的过程示意图。图B.pCasSA系统能有效抑制金黄色葡萄球菌中目标基因的转录。实验选定Newman菌株中agrA和sasE两个基因，使用实时荧光定量PCR检测这两个目标基因的mRNA表达水平，可以看到采用pCasSA系统能显著降低目标基因的表达。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。各实施例中使用的生物材料来源如下：pCas9质粒(购自美国Addgene公司，货号：42876)；pCRISPR质粒(购自美国Addgene公司，货号：42875)；pKOR1质粒(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，货号：3497325)；金黄色葡萄球菌RN4220菌株(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：L2956本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种pCasSA质粒，其序列为SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种pCasSA质粒，其序列为SEQIDNO：1。2.权利要求1所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因敲除中的应用。3.如权利要求2所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因敲除中的应用，其特征在于，所述的基因为agrA基因。4.权利要求1所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的单碱基突变中的应用。5.如权利要求4所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的单碱基突变中的应用，其特征在于，所述的单碱基突变为agrA基因中94位的鸟嘌呤G突变成胸腺嘧啶T。6.权利要求1所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因插入中的应用。7.如权利要求6所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：季泉江，陈未中，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海,31