一种抗虫融合基因、编码蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗虫融合基因、编码蛋白及其应用，所述的基因包括从5’‑3’依次含有编码几丁质结合蛋白的核苷酸序列和编码Vip3毒素的核苷酸序列；且上述2个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内。本发明专利技术所设计的用一个几丁质结合蛋白与一个Vip3毒素融合成的人工蛋白质分子，与原先的几丁质结合蛋白和Vip3蛋白相比，具有如下优点：杀虫谱广，能同时防治鳞翅目和半翅目中多种重要害虫(如甜菜夜蛾、粘虫、粉虱)，杀虫效率高达50％‑100％；有利于具有上述不同功能的蛋白和其它抗虫蛋白(如ICPs)联合使用，进一步扩大杀虫谱，延缓害虫抗性产生。

【技术实现步骤摘要】
一种抗虫融合基因、编码蛋白及其应用(一)
本专利技术涉及一种抗虫融合基因、该抗虫融合基因编码的融合蛋白，及上述融合蛋白的应用。(二)
技术介绍
害虫给全球农业生产带来巨大的损失，目前害虫防治主要依靠化学农药，但是农药的使用加重了生产成本，并且农药残留对人体健康带来严重危害。因此，利用基因工程方法防治害虫具有重大经济、环境和社会价值。获得转基因抗虫作物的关键是克隆优良杀虫蛋白质。杀虫蛋白质有很多，使用得最为广泛的是苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)在产胞期间所分泌一种伴胞晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins，ICP)，如Cry1Ab，Cry1C等，这些蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等昆虫(比如小菜蛾、玉米螟)有很强的杀伤作用(Schnepf,E.,Crickmore,N.,Van,R.J.,Lereclus,D.,Baum,J.,&Feitelson,J.,etal.1998,62(3),775-806.)，目前已被深入研究和广泛使用，玉米、大豆、土豆、棉花等转Bt基因作物已得到大规模商业化种植。苏云金芽胞杆菌在营养生长期间，还会分泌一种与ICPs无氨基酸序列同源性、杀虫机理完全不同的蛋白，即营养期杀虫蛋白(vegetativeinsecticidalproteins，VIPs)，如Vip3A、Vip3B、Vip3C、Vip3D、Vip3H，对一些对ICPs不敏感的害虫也有杀虫活性，并且不会发生交叉抗性(Estruch,J.J.,Warren,G.W.,Mullins,M.A.,Nye,G.J.,Craig,J.A.,&Koziel,M.G.1996,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,93(11),5389-94.)。Vip3蛋白作为一种新型的杀虫蛋白，对目前使用最为广泛的ICP蛋白从杀虫机制、杀虫谱到杀虫活性上都是一个很好的补充。比如，ICPs对斜纹夜蛾和粘虫的杀伤作用很弱，Vip3则对斜纹夜蛾和粘虫有非常好的防治效果。尽管如此，在转基因作物研发的实际操作中，仍然存在一些急需解决的技术性问题。例如，研究人员发现高表达单独的Vip3基因的植株生长比较迟缓，容易出现白化现象。这可能是由于转基因植物中直接表达Vip3蛋白后，该蛋白由于信号肽的分泌作用大量聚集并结合在植物细胞膜上并形成孔道，从而对细胞造成损坏，影响其生长发育。半翅目害虫(如粉虱、飞虱)通过吮吸韧皮部汁液导致植物枯萎、落叶、发育迟缓、减产甚至绝收，对水稻、棉花等粮食和经济作物造成很大的危害。Bt抗虫基因对鳞翅目、鞘翅目等害虫有很好的杀伤作用。但是，目前还没有发现任何Bt蛋白对半翅目害虫有很好防治作用。最近，有科学家从蕨类植物中发现了一种对半翅目害虫具有很好的防治作用的蛋白Tma12，该蛋白是一种具有几丁质酶活性的几丁质结合蛋白(ShuklaAK,UpadhyaySK,MishraM,etal.2016,NatureBiotechnology。第一代转基因作物大多只具有抗鳞翅目害虫的特性，而第二代转基因作物正在向同时抗多种害虫的复合性状发展。获得具有复合性状的转基因作物有多种方法，比如通过对具有单一性状的转基因作物的杂交；通过将多个基因表达框构建在同一个表达框里面；通过共转化，将多个含有单基因的农杆菌混在一起，进行混合转化，筛选出多个基因同时整合了两个或多个质粒T-DNA的转基因植株。但是上述方法在实际操作和应用中都还存在一些问题。因此，获得更为简单高效的获得具有复合性状的转基因作物的方法是当下需要切实解决的问题。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种通过基因融合使得同一个融合蛋白同时对鳞翅目和半翅目具有杀伤效果的方法。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种抗虫融合基因，所述的基因从5’-3’依次包括编码几丁质结合蛋白的核苷酸序列和编码Vip3毒素的核苷酸序列；且上述2个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内。进一步，优选所述的基因从5’-3’依次由编码几丁质结合蛋白的核苷酸序列和编码Vip3毒素的核苷酸序列连接组成。进一步，所述几丁质结合蛋白为Tma12，所述Vip3毒素为Vip3A、Vip3B、Vip3C、Vip3D或Vip3H。更进一步，所述Vip3毒素为Vip3A或Vip3H。进一步，所述抗虫融合基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1(几丁质结合蛋白为Tma12，Vip毒素为Vip3A)或SEQIDNO：2所示(几丁质结合蛋白为Tma12，Vip毒素为Vip3H)。本专利技术还提供一种所述抗虫融合基因编码的融合蛋白，该融合蛋白从N端至C端依次为几丁质结合蛋白和Vip3毒素。进一步，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：3(几丁质结合蛋白为Tma12，Vip3毒素为Vip3A)或SEQIDNO：4(几丁质结合蛋白为Tma12，Vip毒素为Vip3H)所示。本专利技术还提供一种所述的融合蛋白在制备转基因抗虫作物、转基因杀虫微生物或该融合蛋白的抗体中的应用。进一步，所述转基因抗虫作物是由融合蛋白联合BT晶体毒素转化制备而成。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术所设计的用一个几丁质结合蛋白与一个Vip3毒素融合成的人工蛋白质分子，与原先的几丁质结合蛋白和Vip3蛋白相比，具有如下优点：杀虫谱广，能同时防治鳞翅目和半翅目中多种重要害虫(如甜菜夜蛾、粘虫、粉虱)，杀虫效率高达50％-100％；有利于具有上述不同功能的蛋白和其它抗虫蛋白(如ICPs)联合使用，进一步扩大杀虫谱，延缓害虫抗性产生。(四)附图说明图1是本专利技术的融合杀虫蛋白的结构图。融合蛋白中N端为几丁质结合蛋白，C端为Vip3毒素。图2是本专利技术中把杀虫融合蛋白基因导入植物中的T-DNA结构图。pUBI为玉米泛素启动子，融合蛋白基因为几丁质结合蛋白-Vip3毒素融合基因。图3是本专利技术中把杀虫融合蛋白和ICPs联合导入植物中的T-DNA结构图。pUBI为玉米泛素启动子，融合蛋白基因为几丁质结合蛋白-Vip3毒素融合基因，p35S为花椰菜花叶病毒35S启动子，ICPs为伴胞晶体蛋白编码基因。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1、Tma12-Vip3A融合蛋白表达载体的构建Tma12和Vip3A杀虫蛋白的基因均由上海生工合成，其DNA序列分别为SEQIDNO：5和中国专利200610049611.0中的SEQIDNO：7，并克隆在pET28a表达载体的限制性内切酶BamHI和SacI位点之间。构建好的载体分别命名为pET28a-Tma12和pET28a-Vip3A。Tma12-Vip3A合成具体步骤如下：1、以Vip3A(中国专利200610049611.0中的SEQIDNO：7)作为模板经过PCR获得Vip3A基因片段。2、引物为：Vip3A-F：5’CCCGGGAAGGGTGGAGGAATGAACAAGAACAACACCAAG和Vip3A-R：5’CGAGCTCCTACTTGATGCTCACGTCGTAGAACTTCACGA。这两个引物分别包含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗虫融合基因，其特征在于所述的基因从5’‑3’依次包括编码几丁质结合蛋白的核苷酸序列和编码Vip3毒素的核苷酸序列；且上述2个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内。

【技术特征摘要】
1.一种抗虫融合基因，其特征在于所述的基因从5’-3’依次包括编码几丁质结合蛋白的核苷酸序列和编码Vip3毒素的核苷酸序列；且上述2个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内。2.如权利要求1所述的抗虫融合基因，其特征在于所述的基因从5’-3’依次由编码几丁质结合蛋白的核苷酸序列和编码Vip3毒素的核苷酸序列连接组成。3.如权利要求1或2所述的抗虫融合基因，其特征在于所述几丁质结合蛋白为Tma12，所述Vip3毒素为Vip3A、Vip3B、Vip3C、Vip3D或Vip3H。4.如权利要求1所述的抗虫融合基因，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：张先文，王东芳，沈志成，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33