一种比拉底白刺NbCIPK25基因及其表达蛋白和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种比拉底白刺

【技术实现步骤摘要】
一种比拉底白刺NbCIPK25基因及其表达蛋白和应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种比拉底白刺NbCIPK25基因及其表达蛋白和应用。
技术介绍
比拉底白刺（Nitrariatangutorum）属于无患子目（Sapindales）白刺科（Nitrariaceae）白刺属（Nitraria），主要分布于澳大利亚南部干旱草原或沙漠，为澳洲特有白刺种类。白刺属为强旱生落叶灌木，具有极强耐盐抗旱性。研究表明，比拉底白刺不仅可以生存于含盐量达900mM的环境中，而且还可以改善盐性，提高土壤的肥力，对于生态平衡的维持具有重要作用。此外，白刺果实中含有丰富的生物碱、黄酮和酚酸等类活性物质，具有降血压，降血脂，抗氧化，抗肿瘤以及抗炎等药用价值。因此，白刺作为一种生态和经济植物逐渐受到关注。目前，比拉底白刺的研究主要包括种源分布，生物碱类活性物质及抗旱耐盐生理生化性质等方面，为比拉底白刺的育种，活性物质开发利用及抗逆分子机理的研究提供数据支持，也为抗性基因的挖掘与应用奠定基础。CIPKs（CBL-interactingproteinkinase），与CBL形成CBL-CIPK复合体，参与植物在胁迫环境中Ca2+的信号转导，为植物特有的Ser/Thr类磷酸蛋白激酶基因。CIPKs在N端有保守的激酶结构域，负责催化目的蛋白；C端含有NAF结构域，负责与CBL蛋白结合。目前数据表明，在模式植物拟南芥中有26个CIPK类同源异型盒基因，水稻中有30个CIPK类同源异型盒基因，杨树中有27个CIPK类同源异型基因。众多研究表明，CIPK类基因在植物耐盐，耐低钾，抗寒和抗旱等抗逆过程中发挥重要作用。目前有研究报道的是鹰嘴豆的CIPK25基因，其研究结果表明鹰嘴豆在NaCl，PEG，低温，ABA，IAA，MeJA及SA等处理环境下，其CIPK25基因均上调表达以响应胁迫环境；CaCIPK25在盐胁迫条件下，可以促进转基因烟草的种子萌发及根生长，提高转基因烟草的耐盐性。此外，胡杨的PeCIPK25基因与PeCBL1形成复合体调节Na+/K+平衡。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种比拉底白刺NbCIPK25基因。本专利技术的另一目的是提供比拉底白刺NbCIPK25基因的表达蛋白。本专利技术还有一目的是提供比拉底白刺NbCIPK25基因在植物抗旱耐盐育种中的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种比拉底白刺NbCIPK25基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述的比拉底白刺NbCIPK25基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。上述的比拉底白刺NbCIPK25基因在植物抗旱耐盐育种中的应用。含有比拉底白刺NbCIPK25基因的载体。含有比拉底白刺NbCIPK25基因的宿主细胞。有益效果：与现有技术相比，本专利技术结合比拉底白刺的抗旱耐盐特性，利用比拉底白刺的叶片提取组织RNA，通过同源比对设计引物，克隆了比拉底白刺抗旱耐盐相关的CIPK基因片段，再通过5’RACE和3’RACE技术获得基因全长，并根据拟南芥中的同源基因而命名为NbCIPK25。再通过农杆菌介导法及拟南芥花絮侵染法获得转基因拟南芥植株。在正常培养环境中，比拉底白刺NbCIPK25基因过表达的拟南芥T3代纯合植株的生长发育状态与野生型拟南芥无明显差异。在干旱及盐胁迫处理过程中，纯合转基因拟南芥植株的抗旱耐盐性显著高于野生型拟南芥，由此证明了比拉底白刺NbCIPK25基因在植物抗旱耐盐方面的功能，为植物抗逆基因库增加了资源，对于提高植物的抗逆性研究具有重要意义。附图说明图1是比拉底白刺总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图；图2是NbCIPK25基因完整开放阅读框克隆的PCR结果图；图3是NbCIPK25基因的表达载体图；图4是NbCIPK25转基因拟南芥在含0mMNaCl,100mMNaCl和150mMNaCl培养基上萌发4天和10天的状态图；图5是NbCIPK25转基因拟南芥在含0mMNaCl,100mMNaCl和150mMNaCl培养基上萌发4天的萌发率统计图；图6是NbCIPK25转基因拟南芥在分别添加0mMNaCl,100mMNaCl和150mMNaCl的1/2MS培养基上处理14天的生长状态图；图7是NbCIPK25转基因拟南芥在分别添加0mMNaCl,100mMNaCl和150mMNaCl的1/2MS培养基上处理14天的根长统计图；图8是NbCIPK25转基因拟南芥在分别添加0mM,100mM,150mM,200mM甘露醇的1/2MS培养基上萌发3天的状态图；图9是NbCIPK25转基因拟南芥在分别添加0mM,100mM,150mM,200mM甘露醇的1/2MS培养基上萌发3天的萌发率统计图；图10是NbCIPK25转基因拟南芥在分别添加0mM和150mM甘露醇的1/2MS培养基上处理4天的生长状态和根数、叶数及根长统计结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1以比拉底白刺的叶片为材料，提取总RNA，并反转成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。确定为目的序列后，依据该序列设计RACE引物，PCR获取5’和3’序列，测序分析后，拼接得到NbCIPK25全长序列。依据全长序列设计引物，PCR获得全长片段，与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，再次测序和分析，确定为全长目的片段。在目的片段两端添加酶切位点。表达载体pBI121双酶切后，在T4连接酶的作用下与目的片段相连。重组载体转入农杆菌EHA105和GV3101中，等待拟南芥适龄后，利用花絮浸泡法进行转化，并通过抗生素筛选及PCR检测鉴定获取T1代，T2代及T3代纯合转基因植株，然后对纯合转基因植株和野生型植株进行抗旱耐盐性对比分析。具体如下：（1）总RNA的提取以比拉底白刺的叶片为材料，按照NORGEN试剂盒（NorgenBiotek）的操作步骤进行RNA提取，所使用的试剂和耗材均处理使其无RNA酶。比拉底白刺叶片总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，条带较清晰；测定总RNA的吸光度，OD260/OD280值为2.02，OD260/OD230为1.91，可用作基因克隆。RNA提取的具体过程为：在0.1%DEPC溶液过夜处理的研钵中加入液氮进行充分磨样，然后取800μLLysisSolution于样品中进行匀浆后转移至2mL新管。12000rpm离心2min，取上清移至新管中。加入等体积的70%乙醇，涡旋混匀。将混合液移至柱子中（下接2mL收集管），离心1min，倒掉滤液，放回收集管。加入400μLWashSolution，离心1min，弃滤液，放回收集管。加入DNaseI工作液，12000rpm离心1min，将滤液吸回柱子上，25-30℃静置15min。加入400μLWashSolution，12000rpm离心1min，弃滤液。再次加入400μLWashSolution，12000rpm离心1min，弃滤液。将柱子放回收集管，12000rpm离心2min，弃收集管。将柱子放入1.5mL管子中加入50μLElutionSoluti本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种比拉底白刺

【技术特征摘要】
1.一种比拉底白刺NbCIPK25基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的比拉底白刺NbCIPK25基因的表达蛋白，其开放阅读框的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈金慧，鲁路，张文军，成铁龙，施季森，张景波，杨秀艳，史胜青，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32