一种超氧化物歧化酶Cu,Zn‑SOD基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域,特别涉及一种超氧化物歧化酶Cu,Zn‑SOD基因，核苷酸序列如序列表中序列1所示，GLN49(CAG)突变为TRP(TGG)；GLY90(GCT)突变为ILE(ATA)。超氧化物歧化酶Cu,Zn‑SOD基因在氧自由基清除中的应用。突变前后蛋白稳定性的比较，SOD突变后，分别在37℃，55℃水浴保温一定时间后测酶活，稳定性都提高5‑10倍，耐酸碱性能明显提高，对蛋白酶和胰蛋白酶耐受性也明显提高。

【技术实现步骤摘要】
一种超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因及其应用
本专利技术涉及基因工程
,特别涉及一种超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因,还涉及此基因的应用。
技术介绍
超氧化物歧化酶(SOD)是1938年首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究已经有70多年的历史，1969年由Fridovich和McCord发现其发生作用的机制是发生歧化反应，故正式命名为超超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)。SOD是一种自由基清除剂，广泛存在于自然界一切生物体内，通过催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，减轻或者消除超氧阴离子对机体的氧化或过氧化损害。SOD是体内一种重要的氧自由基清除剂，还是一种应用广泛的药用酶。目前，SOD主要集中在治疗关节炎、类风湿性关节炎、缺血再灌注综合症，具有显著疗效，此外在抗辐射、抗肿瘤和预防衰老起到了重要作用。因此，对人体不断补充SOD具有抗衰老的特殊效果，已被广泛应用于生物医药、保健品和化妆品等行业。根据所含金属离子的不同可以主要将SOD分为三类：①Cu,Zn-SOD:呈蓝绿色，由两个亚基组成，每个亚基含有Cu、Zn两种金属离子，每个亚基的分子量为16kD,主要存在于真核细胞的细胞质中,同时也是目前研究最多的一种SOD；②Mn-SOD:呈粉红色，存在与哺乳动物的线粒体内以及原核生物中，哺乳动物的Mn-SOD主要由四个亚基组成；原核生物中则是由两个亚基组成，每个亚基含有一个Mn离子，每个亚基的分子量为24Kd；③Fe-SOD：呈黄色，由两个亚基组成，每个亚基含有一个Fe，主要存在于原核生物和少数植物细胞内。此外，还包括含有金属Ni的Ni-SOD等。但由于天然SOD作为一种酶用于临床存在体内停滞时间短、半衰期只有6-8min,易于被蛋白酶水解，并且具有免疫原性等不利因素。因此，对SOD进行分子改造以改变分子的理化性质，增加对高温和极端pH等的稳定性，克服上述不利因素就显得十分必要。目前对SOD进行分子改造和化学修饰主要有两条途径。第一种采用聚乙二醇、聚蔗糖、右旋糖酐、肝素、壳聚糖等对SOD的氨基酸残基进行化学修饰，主要是对其非活性部位进行修饰以提高其稳定性并仍能保留最大活性。第二种采用对SOD进行酶切改造以达到降低分子量和抗原性的目的。但是鉴于化学修饰不能实现定点修饰，而酶切改造的SOD在体内半衰期仍然很短。CN101525600A公开了一种提高重组人Cu,Zn-SOD活性蛋白产量的方法，突变位点为人Cu,Zn-SOD蛋白的第6位和111位半胱氨酸残基定点突变为亲水性氨基酸残基，使得裂菌上清中的重组蛋白占重组蛋白总体表达的比例由40％提高到80％，并且从上清中纯化的突变体rhCu,Zn-SOD的比活性与上清中纯化的未突变rhCu,Zn-SOD的相当。此方法只是提高了Cu,Zn-SOD产量，对活性及稳定性并没有影响。能够提高rhCu,Zn-SOD的稳定性的突变，至今仍无相关记载。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中Cu,Zn-SOD的稳定性差的问题，本专利技术提供了一种体内半衰期长、稳定性高的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因。本专利技术还提供了上述基因的应用。本研究拟通过对SOD基因进行突变来改造SOD分子，提高SOD稳定性。传统意义上的氨基酸定点突变，是通过基因突变的方法对某个氨基酸位点的碱基进行突变，借此改变该位点的氨基酸类型。尽管方法比较成熟，但对于实际操作而言，通常需要将某个位点突变为其余19种氨基酸，即单位点全突变扫描或多位点全突变扫描，突变结果往往难以估算，给实验带来困难。随着生物信息学技术的发展，计算机软件在对蛋白结构分析方面发挥着日益重要的作用。最近受到业内广泛重视的DiscoveryStudio4.0(DS)软件是面向生命科学领域新一代分子建模和模拟软件，应用于蛋白质的结构功能研究，以及药物的发现，为生命科学领域提供易用的蛋白模拟、优化工具。本研究采用DiscoveryStudio4.0(DS)软件对昆明鼠Cu,Zn-SOD分子通过突变能及分子动力学分析确定突变位点，进而进行试验验证。本专利技术是通过以下步骤得到的：一种超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因，核苷酸序列如序列表中序列1所示，GLN49(CAG)突变为TRP(TGG)；GLY90(GCT)突变为ILE(ATA)。所述的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因，氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因的载体的构建方法，包括以下步骤：(1)涉及引物，核苷酸序列如下：扩增引物为：上游引物P1:5’-ATAGGATCCATGGCGATGAAAGCGGTGT-3’，下游引物P2:5’-GCAGTCGACTTACTGCGCAATCCCAATCACT-3’，单点突变引物：上游引物P3:5’-GGGTTCCACGTCCATTGGTATGGGGACAATAC-3’，下游引物P4:5’-GTATTGTCCCCATACCAATGGACGTGGAACCC-3’，双点突变引物：上游引物P5:5’-GTGACTGCTATAAAGGACGGTG-3’，下游引物P6:5’-CACCGTCCTTTATAGCAGTCAC-3’，(2)由小鼠血液中提取RNA，反转为cDNA并经上下游引物P1、P2进行PCR得到目的基因序列，然后以目的基因为模板，以单点突变引物P3、P4及双点突变引物P5、P6为引物，通过巢式PCR扩增以得到所需突变基因，切胶回收所需目的片段，酶切转入表达载体。所述的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因在氧自由基清除中的应用。本专利技术的有益效果：突变前后蛋白稳定性的比较，SOD突变后，分别在37℃，55℃水浴保温一定时间后测酶活，稳定性都提高5-10倍，耐酸碱性能明显提高，对蛋白酶和胰蛋白酶耐受性也明显提高。对双突变位点Top10进行10ns的分子动力学模拟，得到最优的突变位点组合为：GLN49突变为TRP；GLY90突变为ILE。附图说明图1为野生型和突变蛋白的RMSD对比图；图2为野生型和突变蛋白的RMSF对比图；图3为野生型和突变蛋白的势能对比图；图4为野生型和突变蛋白的H-Bond对比图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明：实施例1由NCBI中获得来自于猩猩、人、MusMusculus等的Cu,Zn-SOD氨基酸序列；于ClustalX2软件中将来自牛、猩猩、人等的Cu,Zn-SOD氨基酸序列进行比对，并由DNAman对比对图进行处理，确定非保守氨基酸序列为27个。在PDB数据库中由登录号3GTT得到MusMusculus的Cu,Zn-SOD的三维晶体结构，将三维晶体结构导入DiscoveryStudio4.0软件中；本实验使用DiscoveryStudio4.0的以下几个模块对蛋白进行突变：BuildMutants；②CalculateMutationEnergy(Stability)；③PredictStabilizingMutations。将非保守序列的27个氨基酸分别突变为其他19种氨基酸，根据突变前后突变能△△Gmut(△△Gmut＝△Gfolding(mut)-△Gfolding(wt)；△Gfolding＝△Gfold本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种超氧化物歧化酶Cu,Zn‑SOD基因，其特征在于核苷酸序列如序列表中序列1所示。

【技术特征摘要】
1.一种超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因，其特征在于核苷酸序列如序列表中序列1所示。2.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列2所示。3.一种含有权利要求1中所述的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因的载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）涉及引物，核苷酸序列如下：扩增引物为：上游引物P1:5’-ATAGGATCCATGGCGATGAAAGCGGTGT-3’，下游引物P2:5’-GCAGTCGACTTACTGCGCAATCCCAATCACT-3’，单点突变引物：上游引物P3:5’-GGGTTCCACGTCCATTGGTATGGGGAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金锋，李杰，姜曰水，刘哲，魏贝贝，巩志金，车程川，杨革，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37