一种厚藤金属硫蛋白IpMT及其编码基因的应用制造技术

本发明专利技术涉及工程菌酿酒酵母和植物分子生物学领域。本发明专利技术公开了一种厚藤金属硫蛋白IpMT及其编码基因IpMT的应用，所述IpMT基因的cDNA阅读框序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术IpMT基因编码的蛋白质IpMT与酿酒酵母重金属镉的耐受和积累相关。通过构建IpMT基因的酿酒酵母转基因超表达载体，将IpMT基因在酵母中超表达，可以提高酵母对重金属镉的耐受性，并提高酵母中的镉含量，促进酵母体内镉的解毒及富集。该基因可应用于工程菌及植物针对体内镉含量改变的遗传工程育种，用于环境重金属镉污染的微生物和植物修复领域。

【技术实现步骤摘要】
一种厚藤金属硫蛋白IpMT及其编码基因的应用
本专利技术属于生物基因工程领域，具体涉及厚藤金属硫蛋白IpMT(Ipomoeapes-capraemetallothionein，IpMT)及其编码基因IpMT在调控工程菌酿酒酵母镉耐受和镉积累方面的应用。
技术介绍
近年来，重金属污染已成为影响生态环境和人类健康重要因素之一，而重金属对植物(尤其是农作物)生长和品质的影响也成为制约国民经济的重要方面。在中国，以镉污染最为严重。镉是一种生物体非必需的毒性元素，一般在自然界中以非活化的化合物状态存在，含量极低，对生物体的毒性也较弱。随着人类活动对环境的干扰，具有较高生物学活性的镉被越来越多地释放到自然界中，并不同程度地积累于植物和农作物体内，危害植物的生长，并影响农作物的品质。镉也可通过食物链进入人体，从而对人体健康造成危害。厚藤(Ipomoeapes-capraeL.)又名马鞍藤、二叶红薯、马蹄草，主要分布于热带和亚热带地区海边沙滩上及向阳的路边，是一种优良的滨海适生野生植物资源。有研究表明，在重金属污染的铅锌矿地区，野生厚藤对重金属镉的富集系数和转运系数均较高，表明厚藤对镉具有一定的富集能力，具备作为海滩重金属镉污染修复植物的基础。此外，厚藤作为一种泛热带性分布型盐生植物(halophyte)，除了耐盐性强、生长迅速、地上部分生物量较大之外，还具备其他潜在的特征使其在滨海地区重金属污染植物修复方面比淡土植物(glycophyte)或超积累植物(hyperaccumulator)更具有优势。首先，盐生植物通常体内会合成一定的渗透调节剂，用来保护植物免受高盐或渗透压胁迫的伤害，而重金属毒害通常也会造成植物细胞内水平衡失衡和细胞结构紊乱，富余的植物渗透调节剂也可以通过缓解重金属胁迫引起的水分胁迫伤害，从而提高盐生植物对重金属胁迫的耐受性；其次，盐生植物体内具备较强的抗氧化体系，而这些抗氧化物质也会降低重金属引发的氧化胁迫伤害，从而提高植物对重金属毒性的耐受性；此外，盐滞土壤中的盐离子还可在一定程度上促进重金属在植物体内的转移，从而提高盐生植物对重金属的富集效率。金属硫蛋白是生物体内广泛存在的金属结合蛋白，分子量较低，富含半胱氨酸，可以结合镉、锌、铜在内的多种重金属。同时，由于半胱氨酸残基具有较强的还原性，金属硫蛋白也是一个还原性的蛋白，能清除细胞内富余的活性氧，降低由各种逆境胁迫照成的氧化胁迫伤害。研究表明，金属硫蛋白不仅参与体内微量元素的储存、转运和代谢，拮抗电离辐射，清除自由基以及对重金属的解毒作用，还与生物体生长发育、抗病等有关。由于金属硫蛋白的这种特征，决定了该类蛋白已经在医学、环境、食品、化妆品等领域进行了开发和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一个厚藤金属硫蛋白IpMT，及其编码基因IpMT的应用。本专利技术的所阐述的厚藤金属硫蛋白IpMT，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示，其编码基因IpMT的cDNA阅读框核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本专利技术的保护范围内。即所述IpMT基因的cDNA阅读框为如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列。本专利技术的另一目的是提供一种将上述厚藤金属硫蛋白基因IpMT应用于植物基因工程中，用于改变转基因植物对重金属镉的耐受和富集的可能性。本专利技术公开了厚藤金属硫蛋白基因在镉胁迫下的诱导表达特征，表明了该基因参与重金属镉胁迫的应答及解毒。本专利技术采用realtimeRT-PCR的方法鉴定了一个厚藤金属硫蛋白基因在重金属Cd胁迫下的表达特征，论证了该基因为厚藤体内应答重金属镉胁迫的重要基因，进一步延伸了该基因作为影响植物体内镉积累和胁迫的候选功能基因。本专利技术的另一目的是公开一个酿酒酵母重组表达载体，该重组表达载体插入了厚藤金属硫蛋白基因IpMT。将该重组载体转化进入酿酒酵母中，能够在镉胁迫下，提高转基因酵母菌对重金属镉的耐受，并提高酵母细胞内镉积累。本专利技术以厚藤幼苗为材料，提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，设计以下引物分别扩增IpMT基因的cDNA全长序列，用于获取插入至酿酒酵母表达载体pYES2的cDNA阅读框片。引物如SEQIDNO.3(IpMTYEF：5’-TACCGAGCTCGGATCCATGTCTTCCGGTTGCAAGTG-3’)和SEQIDNO.4(IpMTYER：5’-TAGATGCATGCTCGAGCTAACAGTTGCAAGGGTCAC-3’)所示。本专利技术的另一个目的是提供一种酿酒酵母工程菌株及其应用，该酿酒酵母工程菌株转化有上述的酿酒酵母重组表达载体。上述的酿酒酵母工程菌株在对环境中重金属镉污染的修复中的应用。本专利技术的另一个目的是提供一种提高厚藤中重金属镉耐受性的生物制剂。所述提高厚藤中重金属镉耐受性的生物制剂其活性成份来源于上述酿酒酵母重组表达载体或上述酿酒酵母，或其活性成份含有调控IpMT基因表达的生物制品，所述IpMT基因的cDNA阅读框为如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列。本专利技术的另一个目的是提供一种提高厚藤中重金属镉耐受性的生物制剂。所述提高植物中重金属镉积累的生物制剂，其活性成份来源于上述酿酒酵母重组表达载体或上述酿酒酵母，或其活性成份含有调控IpMT基因表达的生物制品，所述IpMT基因的cDNA阅读框为如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列。所述调控植物中重金属镉耐受性或重金属镉积累的方法，该方法包括调控所述植物的IpMT基因的表达，所述IpMT基因的cDNA阅读框为如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列。以上PCR采用高保真的Taq酶进行扩增，并将得到的目的DNA片段进行回收，连接于酵母表达载体pYES2上(BamHI和XhoI之间)，形成重组载体IpMT-pYES2，并测序。采用醋酸锂的方法将上述厚藤金属硫蛋白重组载体转化进入酿酒酵母中，采用诱导的极限培养基(添加半乳糖)培养酵母转化子克隆，以转化pYES2空载体的酵母菌株为对照，30℃培养酵母至OD600为1.5-2，用于检测转基因酵母菌对重金属镉胁迫的耐受性以及对镉积累的变化。在本专利技术中，我们公开了厚藤体内的一个金属硫蛋白基因，该基因在厚藤体内的表达对重金属镉胁迫响应。厚藤金属硫蛋白IpMT基因的表达能够提高酵母菌对重金属镉的耐受性，并影响重金属镉在酵母体内的积累，提供了将该基因应用于工程菌酿酒酵母的耐镉遗传改良的应用，也可应用于针对镉污染微生物修复工程菌的遗传改造；本专利技术也简单阐述了可将该基因应用于植物的遗传改造，培育用于重金属镉污染植物修复的转基因重金属超积累植物。本专利技术的有益效果如下：在本专利技术中，我们通过逆转录PCR扩增获得的一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤金属硫蛋白IpMT和/或IpMT基因在提高植物对重金属镉的耐受中的应用，所述IpMT基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或所述IpMT基因为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
2017.01.24 CN 20171005544001.氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的厚藤金属硫蛋白IpMT和/或IpMT基因在提高植物对重金属镉的耐受中的应用，所述IpMT基因的cDNA阅读框为如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.2互补配对的核苷酸序列，或所述IpMT基因为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列。2.氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的厚藤金属硫蛋白IpMT蛋白和/或IpMT基因在提高植物对重金属镉的积累中的应用，所述IpMT基因的cDNA阅读框为如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.2互补配对的核苷酸序列，或所述IpMT基因为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列。3.插入有IpMT基因的cDNA阅读框序列的酿酒酵母重组表达载体，所述IpMT基因的cDNA阅读框为如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.2互补配对的核苷酸序列，或所述IpMT基因为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列。4.权利要求3所述的酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对重金属镉的耐受性中的应用。5.权利要求3所述的酿酒酵母重组表达载体在提高微生物工程菌株对重金属镉的积累中的应用。6.一种酿酒酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：张美，夏快飞，简曙光，张会，郭艳，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东,44