一种与卵巢癌相关的环状非编码RNA-PUM1的shRNA和应用制造技术

本发明专利技术属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种与卵巢癌相关的环状RNA PUM1的shRNA和应用。针对circPUM1基因设计的shRNA，具体为shRNA1或shRNA2；所述的环状RNA PUM1可作为卵巢癌诊断和治疗的重要靶点。所述的与卵巢癌相关的环状RNA PUM1的shRNA可以用于制备抗卵巢癌药物。

【技术实现步骤摘要】
一种与卵巢癌相关的环状非编码RNA-PUM1的shRNA和应用
本专利技术属于肿瘤分子生物学
，具体涉及一种与卵巢癌相关的环状RNAPUM1的shRNA和应用。技术背景卵巢癌是女性生殖系统死亡率最高的恶性疾病，发病率居妇科肿瘤第三位，其较高的死亡率由于大多数患者确诊时已为晚期，手术治疗后常发生复发和转移，远期预后差。因此，探索卵巢癌发生发展的分子生物学机制对于卵巢癌的早期诊断、预后判断及个体化靶向治疗具有重要意义。近年来随着高通量测序等技术的不断进展，环状RNA（circRNA）越来越多地进入研究者的视野，环状RNA是一种高度保守的闭合的非编码RNA，富含微小RNA（miRNA）结合位点，能够吸附并解除miRNA对靶基因的抑制作用，调控肿瘤发生、发展通路中癌基因或抑癌基因的表达，影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移能力。PUM（Homosapienspumilio）基因已被证实能够影响细胞周期、增殖与分化、调控癌症相关基因的表达，在肿瘤发生和进展中发挥着重要作用，但目前并没有关于PUM1基因转录形成的circPUM1结构在卵巢癌组织中表达情况及作用机制的相关报道。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供PUM1基因在卵巢癌的诊断、治疗及预后评估的应用，尤其是一种与卵巢癌相关的环状RNAPUM1的shRNA和应用。该环状RNA与癌细胞的增殖能力相关，针对其设计的shRNA可应用于抗肿瘤的药物的制备。为了实现上述目的，本专利技术提供一种与卵巢癌相关的circPUM1基因，其DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示；针对circPUM1基因设计的shRNA，具体为shRNA1或shRNA2；针对circPUM1设计shRNA1，所述的shRNA1的topstrand和bottomstrand的核苷酸序列分别SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示；针对circPUM1设计的shRNA2，所述的shRNA的topstrand和bottomstrand的核苷酸序列分别SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5所示。SEQ.ID.NO.2：GATTCTCAACAACAGGGCCCAAGGGATTCAAGAGATCCCTTGGGCCCTGTTGTTGAGAATTTTTTT。SEQ.ID.NO.3：AAAAAAATTCTCAACAACAGGGCCCAAGGGATCTCTTGAATCCCTTGGGCCCTGTTGTTGAGAATC。SEQ.ID.NO.4：GAACAACAGGGCCCAAGGGATGCAGATTCAAGAGATCTGCATCCCTTGGGCCCTGTTGTTTTTTTT。SEQ.ID.NO.5：AAAAAAAACAACAGGGCCCAAGGGATGCAGATCTCTTGAATCTGCATCCCTTGGGCCCTGTTGTTC。所述的环状RNAPUM1可作为卵巢癌诊断和治疗的重要靶点。所述的与卵巢癌相关的环状RNAPUM1的shRNA可以用于制备抗卵巢癌药物。本专利技术的有益效果。本专利技术首次发现circPUM1在卵巢癌组织中高表达，通过转染shRNA能够下调circPUM1的表达，显著抑制癌细胞活性，为卵巢癌相关circRNA的临床治疗和科学研究提供了基础。附图说明图1利用qRT-PCR检测circPUM1在卵巢癌及正常组织中的表达情况。图2circPUM1shRNA转染后，卵巢癌细胞circPUM1表达情况的QRT-PCR。图3利用MTT法检测干扰circPUM1对卵巢癌细胞活性的影响。图4检测干扰circPUM1对卵巢癌细胞凋亡的影响。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术作进一步的说明，以下实施例将有助于对本专利技术的了解，但这些实施例仅为了对本专利技术加以说明，本专利技术并不限于这些内容。在实施例中未作特殊说明的操作方法均为本
常规操作方法。实施例1。一、circPUM1在卵巢癌组织、正常卵巢组织中的表达情况。1.标本采集。在患者知情的情况下，于术中采集卵巢癌、正常卵巢组织标本，生理盐水清洗后，保存于液氮或-80℃超低温冰箱中，备用；组织标本于2014年6月-2016年6月，在中国医科大学附属第一医院手术室，由陈医生采集。2.引物设计。circPUM1RT-PCR引物序列如SEQ.ID.NO.6-7所示。上游引物（SEQ.ID.NO.6）：AGTGTACTGGGAGGAGG。下游引物（SEQ.ID.NO.7）：ATAAGTCCGTGCGTCC。3.应用qRT-PCR方法分别检测circPUM1在卵巢癌、正常卵巢组织的表达量。3.1总RNA抽提。使用RNA抽提试剂RNAisoPlus试剂（宝生物工程有限公司）从正常卵巢组织、卵巢癌组织分离总RNA。将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟；4℃条件下12,000r离心处理5分钟；小心吸取上清液，移入新的离心管中；加入RNAisoPlus的1/5体积量的氯仿，剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化后，室温静置5分钟；4℃条件下，12,000r离心处理15分钟，吸取上清液转移至另一个新的离心管中，向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在30℃下静置10分钟；4℃条件下12,000r离心处理10分钟，弃去上清，沿管壁加入lml的75％的乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，4℃条件下12,000r离心处理5分钟后，弃去乙醇，室温干燥沉淀2-5分钟，加入适量的RNase-free水溶解沉淀后，用UV-2800A型紫外可见分光光度计测定RNA浓度和纯度（定量RNA浓度1ug/ul，OD260/OD2801.8-2.0之间表示RNA纯度较高）。3.2逆转录合成cDNA。逆转录试剂盒HighCapacitycDNAReverseTranscriptionKits购自Invitrogen公司，定量PCR试剂盒PowerSYBRGreenPCRMasterMix购自Invitrogen公司。采用GoScript反转录系统（A5000、A5001），按照以下操作步骤进行反转录得到的cDNA。第一步：取一定量模板RNA加入引物。RNA(1µg/ul)5μl。RandomPrimers(0.5µg/ul)1μl。Oligo(dT)15Primer(0.5µg/ul)1μl。Nuclease-FreeWater(加至10μl)3μl。第二步：将模板RNA与反转录引物（RandomPrimers和Oligo(dT)15Primer）的混合物进行70℃、5min预变性，完成后取出置于冰上。第三步：配制RT-Mix，向每个样品管加入10μl。组分反转录混合液终浓度。Nuclease-FreeWater1.6μl。GoScript™5XReactionBuffer4μl1X。MgCl2(25mM)2μl2.5mM。PCRNucleotideMix1μl0.5mM。RecombinantRNasin®RibonucleaseInhibitor0.4μl20units。GoScript™ReverseTranscriptase1μl。第四步：设置反转录程序，包括退火、延伸、逆转录酶失活三步（退火25℃5min，延伸42℃60min，失活70℃15min，4℃+∞。程序完成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与卵巢癌相关的环状非编码RNA‑PUM1的shRNA，其特征在于，所述的shRNA为shRNA1或shRNA2；针对circPUM1设计shRNA1，所述的shRNA的top strand和bottom strand的核苷酸序列分别SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示；针对circPUM1设计的 siRNA2，所述的shRNA的top strand和bottom strand的核苷酸序列分别SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种与卵巢癌相关的环状非编码RNA-PUM1的shRNA，其特征在于，所述的shRNA为shRNA1或shRNA2；针对circPUM1设计shRNA1，所述的shRNA的topstrand和bottomstrand的核苷酸序列分别SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示；针对circPUM1设计的siRNA2，所述的shRNA的topstrand和bottomstrand的核苷酸序列分别SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO....

【专利技术属性】
技术研发人员：赵杨，宗志红，陈说，关雪，
申请(专利权)人：中国医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21