一种兼具细胞膜穿透效应和双抗氧化物酶活性的76肽及其制备方法技术

本发明专利技术属于人工模拟酶领域，提供了一种兼具细胞膜穿透效应和双抗氧化物酶活性的76肽,氨基酸序列为YGRKKRRQRRRHQHQFGDLSQGAESTGPHYNPLAVPHPQHPGDWGNFAVRD GSLWPFLRHNVYGRPRAUVVHAGED,其特点是，结构中除了含有使细胞膜具有穿透功能的转录活化因子(TAT)序列外，还含有与超氧化物歧化酶(SOD)催化活性中心和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的催化三联体结构,因此，兼具SOD和GPx协同抗氧化能力，在因自由基紊乱诱发的疾病的药物应用中具有极大的潜力。并提供其科学合理，简单实用的制备方法。

【技术实现步骤摘要】
一种兼具细胞膜穿透效应和双抗氧化物酶活性的76肽及其制备方法
本专利技术涉及人工模拟酶领域，是一种兼具细胞膜穿透效应和双抗氧化物酶活性的76肽，具体地说，是一种通过基因重组技术制备的具有超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)双活性的含硒金属76肽化合物。
技术介绍
机体内抗氧化系统的平衡和人类重大疾病的发生与发展息息相关，且机体内氧化还原平衡的维持需要依靠诸多抗氧化酶间的协同作用，仅对单一功能酶的研究很难深入探索这个复杂体系的作用机制，而进行构建具有多种抗氧化活性的模拟酶，有利于对抗氧化多酶体系中各种抗氧化酶的协同作用进行深入研究。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GPx)作为生物体天然抗氧化酶系的重要成员，大量研究表明两者的相互协同作用对清除和人类多种疾病相关的高浓度的ROS(reactiveoxygenspecies,ROS)具有重要作用。因此，对SOD和GPx协同抗氧化效应的模拟化合物的研究至关重要。本申请人所在博士课题组曾经以具有晶体结构的SOD3为模板，保留了其活性必须的氨基酸序列，引入了SOD活性中心的Cu2+和稳定活性基团的Zn2+，同时插入了一段具有GPx底物GSH特异性结合位点的15肽，又通过结构模拟，在特定部位引入了除GPx活性残基Sec以外的对稳定活性部位起到至关重要的氨基酸残基Gln和Trp组成催化三联体，并利用Cys营养缺陷型表达系统，获得一种具有精巧的双酶活性中心结构域的铜锌含硒65肽即Se-CuZn-65P。相对大分子量模拟物，65P作为短肽提高了穿透细胞的效率，但效果依然不够理想。基于此，申请人在Se-CuZn-65P的氨基端连接上人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)反式转录激活因子(trans-activatoroftranscription,TAT)的蛋白穿膜结构域的氨基酸序列，即细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptide,CPP)，使其具有穿透生物膜的能力，命名为Se-CuZn-76P，借助计算机模拟功能建立Se-CuZn-76P的三维结构模型，并与Se-CuZn-65P进行结构比对，分析其活性部位，预测其活性变化。然后在单一蛋白生产(singleproteinproduction,SPP)系统中进行半胱氨酸缺陷表达(cysteineauxotrophicexpression)，酶学特征及穿膜能力鉴定表明，Se-CuZn-76是一种具有双酶活性，位点清晰，结构稳定，催化机理明确且具有穿膜作用和抗氧化协同效应的小分子76肽，其对阐明酶的催化机理以及相互间协同作用有重要意义，而且还有广阔的药用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是，提供一种兼具细胞膜穿透效应和双抗氧化物酶活性的76肽，通过引入系列催化氨基酸群和蛋白穿膜结构域的氨基酸序列，建立具有细胞膜穿透效应并兼具SOD和GPx催化活性的新型双功能模拟酶，其把SOD活性中心结构域和GPx活性中心结构域有机整合在一起，使它们能够在各自发挥活性的基础上又能相互协同作用，细胞穿膜肽使其具有穿透生物膜的能力，赋予其广阔的药用前景。本专利技术的另一目的是，提供一种科学合理，简单实用的兼具细胞膜穿透效应和双抗氧化物酶活性的76肽的制备方法。实现本专利技术目的之一采用的技术方案是：一种兼具细胞膜穿透效应和双抗氧化物酶活性的76肽，结构中含有使细胞膜具有穿透功能的转录活化因子(Trans-activatingtranscriptionalactivator,TAT)序列，其特征是，还含有与超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)相似的结构，其氨基酸一级序列为：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-His-Gln-His-Gln-Phe-Gly-Asp-Leu-Ser-Gln-Gly-Ala-Glu-Ser-Thr-Gly-Pro-His-Tyr-Asn-Pro-Leu-Ala-Val-Pro-His-Pro-Gln-His-Pro-Gly-Asp-Trp-Gly-Asn-Phe-Ala-Val-Arg-Asp-Gly-Ser-Leu-Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asn-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala-Sec-Val-Val-His-Ala-Gly-Glu-Asp。实现本专利技术目的之二采用的技术方案是：一种兼具细胞膜穿透效应和双抗氧化物酶活性的76肽的制备方法，其特征是，它包括以下步骤：1)Se-CuZn-76P分子模型的建立与分析以Se-CuZn-65P氨基酸序列为基础，连接上TAT序列(YGRKKRRQRRR)，利用BLAST数据库和Homology模块进行同源序列比对并建立Se-CuZn-76P的三维结构模型，预测其活性变化；BLAST搜索表明，天然SOD1(PDBentry1HL5,1AZV)，SOD3(PDBentry2JLP)蛋白结构与Se-CuZn-76P有较高的同源性，依据其空间结构建立Se-CuZn-76P三维模型，优化后获得稳定结构，其具有发挥GPx活性的催化三联体(catalytictriad)结构和发挥SOD活性的金属离子配位(metalion-coordinated)结构；2)pColdⅠ(sp-4)-76P重组质粒的构建参照OMEGAPlasmidMiniKitI质粒提取试剂盒说明书:将带有质粒的E.coli接种于5mLLB/抗生素培养液中，37℃摇床培养16h；分次取5.0mL的菌液，室温下10000×g离心1min收集细菌,倒弃培养基；加入250μlSolutionⅠ/RNaseA混合液，旋窝震荡使细胞完全悬浮；加入250μlSolutionⅡ，轻轻颠倒混匀6次；加入350μlSolutionⅢ，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀；室温下，≥10000×g离心10min；转移上清液至套有2mL收集管的HiBindDNA结合柱中，室温下，10000×g离心1min，倒去收集管中的滤液；把柱子重新装回收集管，加入500μlHBBuffer，按上述条件离心，弃去滤液；把柱子重新装回收集管，加入700μlDNAWashBuffer按上述条件离心，弃去滤液。注意：浓缩的DNAWashBuffer在使用之前必需按标签的提示用无水乙醇稀释，重复一次；弃去滤液，把柱子重新装回收集管，10000×g离心空柱2min以甩干柱子基质；把柱子装在干净的1.5mL离心管上，加入50μlElutionBuffer到柱子基质中，静置2min，10000×g离心1min洗脱出DNA。对pET28a-76P和pColdⅠ(sp-4)pPelB质粒进行提取，并采用NdeⅠ和XbaⅠ限制性核酸内切酶对这两个质粒分别双酶切，再用T4DNA连接酶进行连接，双酶切和连接体系如下：双酶切体系20μL如下：37℃温育4h，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果并回收酶切片段；连接体系10μL如下：双酶切后的76P基因4.5μL双酶切后的pColdⅠ(sp-4)载体1.5μLH2O2.5μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种兼具细胞膜穿透效应和双抗氧化物酶活性的76肽，结构中含有使细胞膜具有穿透功能的转录活化因子(Trans‑activating transcriptional activator,TAT)序列，其特征是，还含有与超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)相似的结构，其氨基酸一级序列为：Tyr‑Gly‑Arg‑Lys‑Lys‑Arg‑Arg‑Gln‑Arg‑Arg‑Arg‑His‑Gln‑His‑Gln‑Phe‑Gly‑Asp‑Leu‑Ser‑Gln‑Gly‑Ala‑Glu‑Ser‑Thr‑Gly‑Pro‑His‑Tyr‑Asn‑Pro‑Leu‑Ala‑Val‑Pro‑His‑Pro‑Gln‑His‑Pro‑Gly‑Asp‑Trp‑Gly‑Asn‑Phe‑Ala‑Val‑Arg‑Asp‑Gly‑Ser‑Leu‑Trp‑Pro‑Phe‑Leu‑Arg‑His‑Asn‑Val‑Tyr‑Gly‑Arg‑Pro‑Arg‑Ala‑Sec‑Val‑Val‑His‑Ala‑Gly‑Glu‑Asp。

【技术特征摘要】
1.一种兼具细胞膜穿透效应和双抗氧化物酶活性的76肽，结构中含有使细胞膜具有穿透功能的转录活化因子(Trans-activatingtranscriptionalactivator,TAT)序列，其特征是，还含有与超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)相似的结构，其氨基酸一级序列为：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-His-Gln-His-Gln-Phe-Gly-Asp-Leu-Ser-Gln-Gly-Ala-Glu-Ser-Thr-Gly-Pro-His-Tyr-Asn-Pro-Leu-Ala-Val-Pro-His-Pro-Gln-His-Pro-Gly-Asp-Trp-Gly-Asn-Phe-Ala-Val-Arg-Asp-Gly-Ser-Leu-Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asn-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala-Sec-Val-Val-His-Ala-Gly-Glu-Asp。2.根据权利要求1所述的一种兼具细胞膜穿透效应和双抗氧化物酶活性的76肽，其特征是，它的制备方法，包括以下步骤：1)Se-CuZn-76P分子模型的建立与分析以Se-CuZn-65P氨基酸序列为基础，连接上TAT序列(YGRKKRRQRRR)，利用BLAST数据库和Homology模块进行同源序列比对并建立Se-CuZn-76P的三维结构模型，预测其活性变化；BLAST搜索表明，天然SOD1(PDBentry1HL5,1AZV)，SOD3(PDBentry2JLP)蛋白结构与Se-CuZn-76P有较高的同源性，依据其空间结构建立Se-CuZn-76P三维模型，优化后获得稳定结构，其具有发挥GPx活性的催化三联体(catalytictriad)结构和发挥SOD活性的金属离子配位(metalion-coordinated)结构；2)pColdⅠ(sp-4)-76P重组质粒的构建参照OMEGAPlasmidMiniKitI质粒提取试剂盒说明书:将带有质粒的E.coli接种于5mLLB/抗生素培养液中，37℃摇床培养16h；分次取5.0mL的菌液，室温下10000×g离心1min收集细菌,倒弃培养基；加入250μlSolutionⅠ/RNaseA混合液，旋窝震荡使细胞完全悬浮；加入250μlSolutionⅡ，轻轻颠倒混匀6次；加入350μlSolutionⅢ，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀；室温下，≥10000×g离心10min；转移上清液至套有2mL收集管的HiBindDNA结合柱中，室温下，10000×g离心1min，倒去收集管中的滤液；把柱子重新装回收集管，加入500μlHBBuffer，按上述条件离心，弃去滤液；把柱子重新装回收集管，加入700μlDNAWashBuffer按上述条件离心，弃去滤液。注意：浓缩的DNAWashBuffer在使用之前必需按标签的提示用无水乙醇稀释，重复一次；弃去滤液，把柱子重新装回收集管，10000×g离心空柱2min以甩干柱子基质；把柱子装在干净的1.5mL离心管上，加入50μlElutionBuffer到柱子基质中，静置2min，10000×g离心1min洗脱出DNA；对pET28a-76P和pColdⅠ(sp-4)pPelB质粒进行提取，并采用NdeⅠ和XbaⅠ限制性核酸内切酶对这两个质粒分别双酶切，再用T4DNA连接酶进行连接，双酶切和连接体系如下：双酶切体系20μL如下：37℃温育4h，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果并回收酶切片段；连接体系10μL如下：双酶切后的76P基因4.5μL双酶切后的pColdⅠ(sp-4)载体1.5μLH2O2.5μL45℃温育5min，冷却至室温，使酶切的目的基因和载体进行粘端退火连接，然后加入10×连接缓冲液1μL，T4DNA连接酶0.5μL，16℃连接16h；重组质粒经CaCl2法转化入E.coliDH5α感受态菌株中，在含有100μg/mLAmp的卢-贝(Luria-Bertani,LB)固体培养基中筛选后，挑取单克隆在含有100μg/mLAmp的LB液体培养基中扩增培养，提取pColdⅠ(sp-4)-76P质粒，再用1％琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定；pColdⅠ(sp-4)-76P质粒为4587bp，由76P氨基端被转录增强元件(translationenhancingelement,TEE)、6×组氨酸标签(6×His-Ta...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐亚维，尹锐，楚海娇，杨祥波，田瑞雪，刘晓丹，叶飞，高桂凤，王程，闫飞，闫岗林，
申请(专利权)人：吉林农业科技学院，
类型：发明
国别省市：吉林,22