嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1‑233株及其构建方法技术

嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1‑233株及其构建方法，属于疫苗研究生产技术领域，包括PCV1、PCV2毒株的筛选、表达猪圆环病毒2b型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株的构建、重组病毒核酸、氨基酸序列的组成特征与生物学特性。最终获得可用于工业化生产的表达猪圆环病毒2b型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1‑233株）。

【技术实现步骤摘要】
嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株及其构建方法
本专利技术属于疫苗研究生产
，特别是表达猪圆环病毒2b型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株的构建技术。
技术介绍
猪圆环病毒2型（PCV2）严重危害世界养猪业的健康发展，PCV2广泛分布于世界各地。而猪圆环病毒1型（PCV1）是1974年由德国学者Tischer从PK15传代细胞系中作为一种细胞污染物而首次发现的[TischerI,RaschR,TochtermannG,etal.Characterizationofpapovavirusandpicornavirus-likeparticlesinpermanentpigkidneycelllines[J].ZentralblBakteriolOrigA,1974,226(2):153-167.]，尽管在全球各地流行，但迄今为止并未发现其具有致病能力。而PCV2是随后从病猪体内分离得到的，其与PCV1非常类似，但在抗原性和基因组序列上有很大差异，因而被命名为猪圆环病毒2型（PCV2）。所以，根据PCV的致病性与基因组核酸序列的不同将PCV分为PCV1与PCV2两种基因型。因PCV2能够造成断奶仔猪多系统衰竭综合征、繁殖障碍、猪呼吸道病复合征及皮炎和肾病综合征等多种疾病，给世界养猪业造成了严重危害，因此成为国内外研究的热点。当然，目前研究最多的是PCV2。基于对PCV2核酸序列的比较，又将其分为PCV2a-PCV2e等5个基因亚群，我国目前主要流行的是PCV2b和PCV2d亚群。在20世纪90年代到2000年流行的基因群主要是PCV2a，2001-2010年流行的主要基因群为PCV2b，2011年至今，主要流行PCV2b和PCV2d基因群[XiaoCT,Halbur,OpriessnigT,etal.Globalmoleculargeneticanalysisofporcinecircovirustype2(PCV2)sequencesconfirmsthepresenceoffourmainPCV2genotypesandrevealsarapidincreaseofPCV2d.[J].JGenVirol,2015,96:1830-1841.]。为控制猪圆环病毒病的流行，商品化的亚单位疫苗及全病毒灭活疫苗在世界多地的养猪场得到使用，并取得了一定的效果。PCV2是已知的脊椎动物中最小的可自主复制的无囊膜病毒，具有1.7kb的单链闭合环状负链DNA基因组，其中有三个研究透彻的开放阅读框[WaliaR,DardariR,ChaiyakulM,etal.Porcinecircovirus-2capsidproteininducescelldeathinPK15cells[J].Virology,2014,11:126-132.]。PCV2基因组排列十分紧密，基因组包含11个潜在ORFs，其阅读框大小各异，编码产物大小也相差悬殊。大多数阅读框出现重叠，基因组长度分为两种，一种1767bp，另一种为1768bp[FenauxM,HalburPG,GillM,etal.Geneticcharacterizationoftype2porcinecircovirus(PCV2)frompigswithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeindifferentgeographicregionsofNorthAmericaanddevelopmentofadifferentialPCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismassaytodetectanddifferentiatebetweeninfectionswithPCV1andPCV2[J].JClinMicrobiol,2000,38(7):2494-2503.]。ORF1编码参与病毒基因组复制的两种蛋白质，rep和剪接变异体rep'，而ORF2编码主导免疫原性的cap衣壳蛋白。ORF3编码非结构蛋白，该蛋白具有促凋亡蛋白的特征。PCV2基因组有限的编码容量意味着PCV必须为多功能产物编码，以确保在宿主细胞内稳定高效地复制与转录。由于PCV2感染危害严重，而疫苗是预防该病的有效手段之一，疫苗自然成为全世界研究的热点。Fenaux等（2004）用PCV2的ORF2基因替换非致病性PCV1相应的ORF2基因成功构建出了PCV1-2感染性克隆，其保留了PCV1的非致病性，同时还能诱导猪体产生针对PCV2的特异性抗体[FenauxM,OpriessnigT,HalburPG,etal.Achimericporcinecircovirus(PCV)withtheimmunogeniccapsidgeneofthepathogenicPCVtype2(PCV2)clonedintothegenomicbackboneofthenonpathogenicPCV1inducesprotectiveimmunityagainstPCV2infectioninpigs[J].JVirol,2004,78(12):6297-6303.]。值得强调的是，上述作者在构建PCV1-2时，采用KpnⅠ不完全酶切方法实现PCV1-2双拷贝的构建，经本实验室多年、多次验证，这一方法中的不完全酶切条件难以精准控制，导致构建成功率极低。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提出一种嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株。该嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株的保藏号为CGMCCNo.13592。该材料于2017年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），建议的分类命名为：嵌合型猪圆环病毒1-2b。本专利技术第二目的是提出以上嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株的构建方法。本专利技术方法包括以下步骤：1）构建缺失PCV1ORF2基因组的pSK（+）-PCV1ΔORF2：以PCV1全基因组为模板，用引物KpnI-F和引物KpnI-R扩增出PCV1全基因组；将PCV1全基因组与pGEM-TEasy质粒连接，获得质粒T-PCV1，pBluescriptSK（+）载体的酶切及去磷酸化，再通过T-PCV1基因组的酶切、回收和去磷酸化，将PCV1与pSK（+）载体连接，获得重组质粒pSK（+）-PCV1；以质粒pSK（+）-PCV1为模板，用引物HpaI-R和引物NarI-F扩增出pSK（+）-PCV1ΔORF2基因；2）构建重组质粒pSK（+）-sPCV1-2b：以PCV2b0233株基因组为模板，用引物PsiI-F和引物AclI-R扩增出PCV2bORF2的DNA片段；再将pSK（+）-PCV1ΔORF2与PCV2bORF2连接得到重组质粒pSK（+）-sPCV1-2b；3）构建重组质粒pSK（+）-dPCV1-2b：对重组质粒pSK（+）-sPCV1-2b用KpnⅠ和BstBⅠ进行双酶切，得到1563bp的条带片段；对重组质粒pSK（+）-sPCV1-2b用KpnⅠ和BstEⅡ进行双酶切，得到1543bp的条带片段；对重组质粒pSK（+）-sPCV1-2b用BstB本文档来自技高网...

【技术保护点】
嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1‑233株，保藏号为CGMCC No.13592。

【技术特征摘要】
1.嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株，保藏号为CGMCCNo.13592。2.如权利要求1所述嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1）构建缺失PCV1ORF2基因组的pSK（+）-PCV1ΔORF2：以PCV1全基因组为模板，用引物KpnI-F和引物KpnI-R扩增出PCV1全基因组；将PCV1全基因组与pGEM-TEasy质粒连接，获得质粒T-PCV1，pBluescriptSK（+）载体的酶切及去磷酸化，再通过T-PCV1基因组的酶切、回收和去磷酸化，将PCV1与pSK（+）载体连接，获得重组质粒pSK（+）-PCV1；以质粒pSK（+）-PCV1为模板，用引物HpaI-R和引物NarI-F扩增出pSK（+）-PCV1ΔORF2基因；2）构建重组质粒pSK（+）-sPCV1-2b：以PCV2b0233株基因组为模板，用引物PsiI-F和引物AclI-R扩增出PCV2bORF2的DNA片段；再将pSK（+）-PCV1ΔORF2与PCV2bORF2连接得到重组质粒pSK（+）-sPCV1-2b；3）构建重组质粒pSK（+）-dPCV1-2b：对重组质粒pSK（+）-sPCV1-2b用...

【专利技术属性】
技术研发人员：高崧，刘秀梵，高清清，王小波，高如一，何洪波，李基棕，樊铭玉，程清如，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32