一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法技术

本发明专利技术的一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法，其中，包括步骤：将枯草芽孢杆菌种于培养基中培养，得到枯草芽孢杆菌；在新的培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度不同的培养基；先在鲎素浓度较低的培养基中接入得到的枯草芽孢杆菌进行划线培养，得到耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌；然后在下一个鲎素浓度较高的培养基中接入得到的耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌进行划线培养，依次类推，逐步提高鲎素浓度，培养出能够耐受较高浓度鲎素的枯草芽孢杆菌。本发明专利技术使用添加梯度浓度鲎素的培养基持续对枯草芽孢杆菌进行长期定向选育，获得抗鲎素耐受型菌株。鲎素长期持续诱导得到的菌株对鲎素产生了较强的耐受性。

【技术实现步骤摘要】
一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法
本专利技术涉及微生物类领域，尤其涉及一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法。
技术介绍
鲎素是从鲎血细胞小颗粒分离提取的一种阳离子抗菌肽，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖和诱导癌细胞分化等生物活性,是一种具有巨大潜在应用价值的抗菌肽。鲎素主要有从鲎血细胞分离纯化、化学合成及基因工程表达三种生产手段。由于鲎资源匮乏以及化学合成的高成本，前两种方法很难进行大规模生产，因此，基因工程表达生产鲎素是实现其产业化的必由之路。国内外对鲎素基因工程表达的研究从上个世纪九十年代后期就开始了，但重组鲎素商品至今尚未问世。其中最主要的原因是各种表达宿主均不能克服鲎素I的抑杀及对鲎素I的降解作用，从而导致表达量达不到产业化的要求。因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法，旨在解决现有技术中表达宿主均不能克服鲎素I的抑杀及对鲎素I的降解作用的问题。本专利技术的技术方案如下：一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，包括步骤：A、将枯草芽孢杆菌种于培养基中培养，得到枯草芽孢杆菌；B、在新的培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度不同的培养基；先在鲎素浓度较低的培养基中接入步骤A得到的枯草芽孢杆菌进行划线培养，得到耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌；C、然后在下一个鲎素浓度较高的培养基中接入步骤B得到的耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌进行划线培养，依次类推，逐步提高鲎素浓度，培养出能够耐受较高浓度鲎素的枯草芽孢杆菌。所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，步骤B中，在新的培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL……直到160μg/mL的培养基。所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，各鲎素浓度的培养基下划线培养的方法为：各鲎素浓度下反复培养20~40次。所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，所述培养基为BLM培养基。所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，培养的条件为：温度为37℃，200rpm的振荡培养箱中培养。所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，还包括：对各阶段划线培养得到的耐受鲎素的枯草芽孢杆菌进行形态观察及污染监控。所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，将各阶段划线培养得到的耐受鲎素的枯草芽孢杆菌接入含25%甘油的培养基中保存。一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌，其中，引用如上任一所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法制备而成。所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌，其中，所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌为耐受160μg/mL鲎素的枯草芽孢杆菌。有益效果：本专利技术使用添加梯度浓度鲎素的培养基持续对枯草芽孢杆菌进行长期定向选育，获得抗鲎素耐受型菌株。鲎素长期持续诱导得到的菌株对鲎素产生了较强的耐受性。耐受菌株的超微形态结构发生一定的改变，同时细胞膜渗透性、膜表面电荷及耐药分子表达水平均朝着有利于耐受鲎素的方向变化。这些耐药表型的改变有助于耐受鲎素的枯草芽孢杆菌适应鲎素的长期胁迫。附图说明图1为本专利技术的一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法较佳实施例的流程图。图2为原始菌(WB800)的形态图。图3为诱导菌(WB800-160)的形态图。图4为原始菌(WB800)和诱导菌(WB800-160)的表面电荷差异示意图。图5为原始菌(WB800)和诱导菌(WB800-160)的dlt基因表达情况示意图。图6为原始菌(WB800)和诱导菌(WB800-160)的生长曲线示意图。具体实施方式本专利技术提供一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术菌株的分类名称为：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），其保藏编号为：GDMCCNo.60095，保藏日期为：2016年10月19日，保藏地址为：广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心。图1为本专利技术的一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法较佳实施例的流程图，如图所示，其包括步骤：S100、将枯草芽孢杆菌种于培养基中培养，得到枯草芽孢杆菌；步骤S100具体为，挑选枯草芽孢杆菌种于BLM液体培养基中，37℃下，200rpm振荡培养中培养，直到枯草芽孢杆菌液OD600值达到约1.25。S200、在新的培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度不同的培养基；先在鲎素浓度较低的培养基中接入步骤S100得到的枯草芽孢杆菌进行划线培养，得到耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌；步骤S200具体为，本专利技术预先检测原始枯草芽孢杆菌在BLM液体培养基中的最小抑菌浓度（MIC）值，测得鲎素对原始枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为10μg/mL。本专利技术以MIC值的一半（即1/2MIC，5μg/mL）为起始诱导浓度。本专利技术从低浓度鲎素开始进行诱导，目的是使菌株能对鲎素进行逐步适应，以便获得更加稳定的诱导菌株。然后配制鲎素浓度不同的培养基，具体是在新的BLM培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL……直到160μg/mL的培养基。接着，先在5μg/mL鲎素浓度的培养基中接入步骤S100得到的枯草芽孢杆菌进行培养，培养的条件为：温度为37℃，200rpm的振荡培养箱中培养。再通过划线培养的方法，得到纯的耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌。划线培养具体是，在5μg/mL鲎素浓度的培养基中反复培养20~40次（如25次），即在5μg/mL鲎素浓度下反复诱导耐受鲎素的枯草芽孢杆菌20~40次（如25次），使耐受鲎素的枯草芽孢杆菌达到稳定耐受，且该耐受鲎素的枯草芽孢杆菌能够耐受5μg/mL鲎素。S300、再在下一个鲎素浓度较高的培养基中接入步骤S200得到的耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌进行划线培养，依次类推，逐步提高鲎素浓度，培养出能够耐受较高浓度鲎素的枯草芽孢杆菌。步骤S300具体为，按步骤S200中的方法进行10μg/mL鲎素的耐受诱导，同样反复培养20~40次（如25次），即在10μg/mL鲎素浓度下反复诱导耐受鲎素的枯草芽孢杆菌20~40次（如25次），使耐受鲎素的枯草芽孢杆菌达到稳定耐受，且该耐受鲎素的枯草芽孢杆菌能够耐受10μg/mL鲎素。然后按照同样的方法，逐步提高鲎素浓度，依次在20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL……直到160μg/mL的鲎素浓度下反复诱导耐受鲎素的枯草芽孢杆菌20~40次（如25次），通过长期诱导后，获得可以耐受160μg/mL鲎素的枯草芽孢杆菌。耐受160μg/mL鲎素的枯草芽孢杆菌再通过反复诱导后，最终可获得可以耐受256μg/mL鲎素的枯草芽孢杆菌。本专利技术还包括：对各阶段的耐受鲎素的枯草芽孢杆菌进行形态观察及污染监控，以免因污染而导致菌种不纯。本专利技术还将各阶段划线培养得到的耐受鲎素的枯草芽孢杆菌接入含体积比25%甘油的培养基中保存。本专利技术培养基不限于BLM培养基，也可以用MH肉汤进行替代。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，包括步骤：A、将枯草芽孢杆菌种于培养基中培养，得到枯草芽孢杆菌；B、在新的培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度不同的培养基；先在鲎素浓度较低的培养基中接入步骤A得到的枯草芽孢杆菌进行划线培养，得到耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌；C、然后在下一个鲎素浓度较高的培养基中接入步骤B得到的耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌进行划线培养，依次类推，逐步提高鲎素浓度，培养出能够耐受较高浓度鲎素的枯草芽孢杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，包括步骤：A、将枯草芽孢杆菌种于培养基中培养，得到枯草芽孢杆菌；B、在新的培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度不同的培养基；先在鲎素浓度较低的培养基中接入步骤A得到的枯草芽孢杆菌进行划线培养，得到耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌；C、然后在下一个鲎素浓度较高的培养基中接入步骤B得到的耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌进行划线培养，依次类推，逐步提高鲎素浓度，培养出能够耐受较高浓度鲎素的枯草芽孢杆菌。2.根据权利要求1所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，步骤B中，在新的培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL……直到160μg/mL的培养基。3.根据权利要求1所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，各鲎素浓度的培养基下划线培养的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：代建国，唐勇军，金刚，
申请(专利权)人：深圳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：广东,44