本发明专利技术公开了一种基于弹涂鱼卵黄蛋白原的水体雌激素污染检测方法，属于分子生物学及环境污染检测领域；所述弹涂鱼卵黄蛋白原的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。目前尚未有滩涂鱼类用于环境雌激素的生物活体检测，其相应的生物检测技术缺乏。本发明专利技术选择滩涂定居性强对生境敏感的弹涂鱼Periophthalmus modestus活体模型，设计引物，采用实时定量荧光PCR法检测其卵黄蛋白原VtgAa的表达，该检测方法可用于海水，河流入海口等水域环境雌激素污染程度的检测。
【技术实现步骤摘要】
基于弹涂鱼多型卵黄蛋白原的水体雌激素污染检测方法
本专利技术属于分子生物学及环境污染检测领域，具体涉及一种基于新型滩涂模式鱼类-弹涂鱼多型卵黄蛋白原(vitellogenin，vtg)的水体环境雌激素检测方法，可广泛运用于河口滩涂水域的环境雌激素污染程度的评估。
技术介绍
工业高速发展的当代，大量化学物质在环境中不合理地释放、现代农业对农药地过分依赖都对环境造成了极大地污染。越来越多的证据表明，环境中存在多种能模拟和干扰动物及人类内分泌机能的物质。这些外源性化合物进入机体后，干扰机体内分泌的合成、释放、运输、代谢、结合等过程，并由此造成动物的雌雄性别的改变以及畸形等病变。这一大类物质称为环境内分泌干扰物(EnvironmentalEndocrineDisrupters，EEDs)、环境雌激素(Enviromentalestrogens)、或内分泌活性化合物(Endocrineactivecompounds)。环境雌激素问题与臭氧层破坏及温室效应相提并论，足见对其重视程度。目前大部分内分泌干扰物的研究工作还是针对单一化合物的模拟暴露，实际环境体系却包含一系列具有不同雌激素活性的物质。所以，基于单种物质的毒理学数据很难对生态风险进行准确的评估。研究混合物的雌激素活性比研究单种物质更符合实际环境所存在的状态。由不可见效应浓度的几种类雌激素物质组成的混合物具有明显的雌激素活性。建立经济、方便、灵敏的环境雌激素混合物活性检测方法，特别是寻找高效、特异、灵敏的生物标志物已成为环境内分泌干扰物质研究的焦点。环境雌激素种类繁多，化学分析不能穷究环境样品中的所有具有雌激素效应的污染物，而且仅由环境雌激素的浓度并不能得知其毒性效应的强弱。再次，化学分析方法对仪器的依赖度高，耗时耗力。而生物标志物的运用很好的解决了这一缺陷，通过测定样品的整体内分泌干扰效应而无需知道样品的详细化合物组成，且操作简单、快速、经济和高效的优点，已经成为监测环境内分泌干扰物的主要手段。弹涂鱼Periophthalmusmodestus，隶属于鲈形目、虾虎鱼亚目、弹涂鱼科、弹涂鱼属，栖息于河口咸淡水水域、近岸滩涂处或底质烂泥的低潮区，为沿岸暖水广温广盐性鱼类。鱼类的卵黄蛋白原(vitellogenin，Vtg)是在雌二醇(estradiol-17β，E2)作用下经肝脏合成后分泌到血液中的卵黄前驱蛋白。通常情况下，Vtg是雌鱼在卵黄形成时期血液中出现的雌特异性血清蛋白，但雄鱼和稚鱼在外源性雌激素作用下同样能诱导体内Vtg的生成。根据这一特性，Vtg除了可作为判断性别和雌鱼成熟度的指示蛋白外，也可通过检测雄鱼或稚鱼体内Vtg的异常生成来评价水域环境中外源性雌激素物质(环境雌激素)的污染状况(Specker&Sullivan，1994)。目前国内外已有部分针对卵黄蛋白原开发出类雌激素污染检测方法，但所选择的鱼类模型主要为淡水鲤科鱼类，未见滩涂水域鱼类用于环境雌激素检测方面的专利报道。而淡水鲤科鱼类和弹涂鱼生活的水体完全不同，弹涂鱼由于其生境的特殊性，在环境雌激素检测上的应用具有鲤科鱼类不可替代的实际意义。本研究选用滩涂定居性弹涂鱼作为活体模型，建立了针对卵黄蛋白原的活体环境检测技术，具有较高的创新性和实用性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于弹涂鱼多型卵黄蛋白原的水体雌激素污染检测方法，将其运用于各水域的环境雌激素污染检测。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术涉及一种弹涂鱼卵黄蛋白原在作为检测环境雌激素污染的指示蛋白中的用途，所述弹涂鱼卵黄蛋白原的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。优选的，编码所述弹涂鱼卵黄蛋白原的弹涂鱼VtgAa基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第3位～第5000位所示。第二方面，本专利技术涉及一种检测水生环境污染的测试方法，所述方法包括检测水生环境中的鱼类中弹涂鱼卵黄蛋白原的表达水平，所述弹涂鱼卵黄蛋白原的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。优选的，所述水生环境污染是雌激素效应。优选的，所述方法包括如下步骤：S1、从弹涂鱼幼鱼或雄鱼的肝脏组织中提取总RNA，进行反转录扩增；S2、分别设计VtgAa和内参ef1-α基因荧光定量PCR引物，建立绝对定量PCR法；S3、对样品中的卵黄蛋白原VtgAa的mRNA表达水平进行定量，分析样品的环境雌激素污染程度。第三方面，本专利技术涉及一种克隆弹涂鱼VtgAa基因全长序列的方法，所述方法包括如下步骤：A1、从性成熟期弹涂鱼雌鱼的肝脏组织中提取总RNA，进行反转录扩增；A2、设计VtgAa的简并引物进行扩增反应，获得VtgAa基因片段；A3、以弹涂鱼总RNA为模板根据RACE法分别制备VtgAa基因3’端和5’端cDNA序列；A4、设计特异性全长引物，扩增获得VtgAa基因全长序列。优选的，步骤A2中，VtgAa基因对应的简并引物为如SEQIDNO.3所示的vtgAa-degenerate-F1和如SEQIDNO.4所示的vtgAa-degenerate-R1。优选的，步骤A3中，VtgAa基因对应的RACE引物为如SEQIDNO.7所示的vtgAa-5′RACE-GSP1和如SEQIDNO.8所示的vtgAa-3′RACE-GSP2。优选的，步骤A4中，VtgAa基因对应的特异性全长引物为如SEQIDNO.11所示的vtgAa-fullprimer-F1和如SEQIDNO.12所示的vtgAa-fullprimer-R1。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术获得了弹涂鱼VtgAa基因全长CDS序列，填补了弹涂鱼Vtg基因家族的空白。2、弹涂鱼是我国东南沿海广泛分布的常见河口性鱼类，Vtg是了解河口咸淡水水域、近岸滩涂处或底质烂泥的低潮区环境雌激素污染的重要生物标志物，获得VtgAa基因全长，对于更准确指示相应水域污染状况，以及更深入探究水生生物在污染水域的蛋白表达等问题具有重要意义。3、本专利技术通过设计特异性引物，建立了弹涂鱼VtgAa和ef1-α(内参)基因的实时荧光定量PCR方法。运用荧光定量PCR法检测了VtgAa在雌激素诱导下的表达水平的变化情况，进而指示出环境中的雌激素污染情况。附图说明图1为弹涂鱼卵黄蛋白原VtgAa和ef1-α基因的cDNA全长电泳图；其中，M：Marker，1：VtgAa，2：ef1-α；图2为弹涂鱼VtgAa基因和内参基因ef1-α的荧光定量PCR的标准曲线图；图3为不同浓度雌激素不同时间诱导下，VtgAa表达水平的变化。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例本实施例涉及一种弹涂鱼多型卵黄蛋白原(vitellogenin，vtg)基因、编码蛋白及其应用、克隆cDNA全长序列的方法。VtgAa基因：本专利技术的弹涂鱼多型VtgAa基因，其特征在于VtgAa序列全长5223bp，包含起始密码子ATG、终止密码子TAG及polyA。该基因的开放阅读框(ORF)位于3～5000bp，长4998bp，共编码16本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种弹涂鱼卵黄蛋白原在作为检测环境雌激素污染的指示蛋白中的用途，所述弹涂鱼卵黄蛋白原的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种弹涂鱼卵黄蛋白原在作为检测环境雌激素污染的指示蛋白中的用途，所述弹涂鱼卵黄蛋白原的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，编码所述弹涂鱼卵黄蛋白原的弹涂鱼VtgAa基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第3位～第5000位所示。3.一种检测水生环境污染的测试方法，其特征在于，所述方法包括检测水生环境中的鱼类中弹涂鱼卵黄蛋白原的表达水平，所述弹涂鱼卵黄蛋白原的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求3所述的检测水生环境污染的测试方法，其特征在于，所述水生环境污染是雌激素效应。5.根据权利要求3所述的检测水生环境污染的测试方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、从弹涂鱼幼鱼或雄鱼的肝脏组织中提取总RNA，进行反转录扩增；S2、分别设计VtgAa和内参ef1-α基因荧光定量PCR引物，建立绝对定量PCR法；S3、对样品中的卵黄蛋白原VtgAa的mRNA表达水平进行定量，分析样品的环境雌激素污染程度。6.一种克隆弹涂鱼VtgAa基因全长序列的方法，所述方法包括如下步骤：A1、从性成熟期弹涂鱼雌鱼的肝脏组织中提取总RN...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴美琴，陈渊戈，葛珂珂，练青平，
申请(专利权)人：上海海洋大学，中国水产科学研究院东海水产研究所，宁海县三门湾现代渔业园区管委会，浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31
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