用于辅助检测结核病的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种辅助检测结核病的试剂盒，其包括用于检测可能存在于待检患者血液中的外泌体内的Hsp16.3蛋白的物质。同时，本发明专利技术还公开了通过检测血液外泌体中的Hsp16.3蛋白来诊断结核病的辅助检测方法。较之现有技术，藉由本发明专利技术通过检测待检患者血液中是否含有结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白来判断待检患者是否为结核病人，只需少量检测样品(所需的待检患者血液低于1mL)即可在一天以内快速完成检测，同时具有优良特异性，适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
用于辅助检测结核病的试剂盒
本专利技术具体涉及一种用于辅助检测结核病的试剂盒及方法。
技术介绍
结核病是一种由结核分枝杆菌引起的呼吸道传播为主的慢性疾病，是严重威胁人类健康的一种人畜共患传染病。全世界约有1/3的人口感染结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80％。其中大部分结核分枝杆菌感染者为潜伏感染者，他们在一生当中发展为活动性结核病的概率为5％-10％。结核分枝杆菌潜伏感染时，病人没有临床症状、没有放射检查症象、没有病菌学依据、结核纯蛋白衍生物的皮试为阳性。这些现象的存在，主要是因为结核分枝杆菌在体内以休眠状态存在，这些休眠菌在体内可存在数年而机体没有任何不适反应，当机体免疫力降低时，结核分枝杆菌又开始生长繁殖，导致疾病发生。因此，结核病治疗急需一种能客观准确反映结核病转归以及治疗效果的新型指标。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种用于辅助检测结核病的试剂盒以及辅助检测结核病的方法，以克服现有技术中的不足。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例提供了用于辅助检测结核病的试剂盒，包括用于检测可能存在于待检患者血液中的外泌体内的Hsp16.3蛋白的物质。进一步的，所述Hsp16.3蛋白存在于结核病患者血液中的外泌体内。进一步的，所述用于检测Hsp16.3蛋白的物质包括Hsp16.3蛋白的抗体。进一步的，所述的试剂盒还可包括用以提取待检患者血液中外泌体的提取试剂。进一步的，所述的试剂盒还可包括用于鉴定通过所述提取试剂从待检患者血液中提取出的提取物是否为外泌体的鉴定试剂。进一步的，所述鉴定试剂包括用于检测CD63蛋白的物质。更进一步的，所述用于检测CD63蛋白的物质包括CD63蛋白的抗体。进一步的，本专利技术实施例还提供了所述试剂盒的使用方法，其可以包括：(1)提取待检患者血液中的外泌体；(2)检测步骤(1)所获提取物中是否包含CD63蛋白，若是，则判定所述提取物为外泌体；(3)检测所述外泌体中是否包含Hsp16.3蛋白，若是，则判定待检患者为结核病患者。本专利技术实施例还提供了用于检测Hsp16.3蛋白的物质在制备辅助检测结核病的试剂盒中的应用。进一步的，所述用于检测Hsp16.3蛋白的物质包括Hsp16.3蛋白的抗体。本专利技术实施例还提供了用于检测Hsp16.3蛋白的物质及用于检测CD63蛋白的物质在制备辅助检测结核病的试剂盒中的应用。进一步的，所述用于检测Hsp16.3蛋白的物质包括Hsp16.3蛋白的抗体。进一步的，所述用于检测CD63蛋白的物质包括CD63蛋白的抗体。在本专利技术中，前述Hsp16.3蛋白的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体等。这些物质可以通过多种已知途径获取，例如可直接商购用于检测Hsp16.3蛋白的试剂盒。在本专利技术中，前述CD63蛋白的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体等。这些物质也可以通过多种已知途径获取，例如可直接商购用于检测CD63蛋白的试剂盒。显然的，前述的试剂盒还可包括其它辅助试剂，例如业界已知的各类合适细胞培养基、病毒培养基、缓冲液等等，且不限于此。进一步的，所述的试剂盒还包括用以提取待检患者血液中外泌体的试剂。进一步的，所述试剂盒的操作方法可以包括：提取待检患者血液中的外泌体；利用所述用于检测CD63蛋白的物质检测提取物是否为外泌体；利用所述用于检测Hsp16.3蛋白的物质检测所述外泌体中是否存在Hsp16.3蛋白。在本专利技术中，所述辅助检测结核病包括辅助检测待测患者是否为结核病患者。相应的，本专利技术实施例还提供了辅助检测结核病的方法，其主要是通过检测外泌体蛋白来诊断结核病。进一步的，所述辅助检测结核病的方法包括：通过检测人血浆中的外泌体是否含有结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白，来作为判断结核病患者的辅助诊断依据。进一步的，所述辅助检测结核病的方法可以通过前述的试剂盒实施。在本专利技术中，前述Hsp16.3蛋白是存在于结核分枝杆菌菌膜上的主要抗原蛋白。本案专利技术人研究发现，Hsp16.3蛋白的表达和结核分枝杆菌的潜伏感染及休眠菌的形成密切相关。在本专利技术中，前述外泌体(exosome)是细胞分泌的大小在30～100nm的胞外囊泡，其膜组成成分复杂且不稳定。外泌体中包含胞质环境中富含的DNA、RNA、蛋白质和其它分析物，具体成分与其来源的细胞密切相关。外泌体与细胞膜融合后，可将所携带的物质和信号传递到受体细胞并改变其生物学功能。从巨噬细胞、T细胞等抗原呈递细胞来源的外泌体膜上含有完整的主要组织相容性复合物(MHC)，该分子能被T-细胞的识别并执行一系列免疫功能。本案专利技术人在研究中发现，结核分枝杆菌感染巨噬细胞后，分泌的外泌体和Hsp16.3蛋白都具有提呈抗原，活化B、T淋巴细胞的重要作用，受到结核分枝杆菌感染的巨噬细胞会分泌含结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白的外泌体。较之现有技术，本专利技术能在较短时间内(一天以内)通过检测少量血液(低于1mL)中是否含有结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白而准确判断待检患者是否为结核病人，无需特别昂贵的仪器设备等，操作简单，具有很好的特异性，适于推广应用。附图说明图1A是本专利技术一典型实施例中受到重组慢病毒rLV-Hsp16.3-ZsGreen1感染的U937细胞的光学照片。图1B是本专利技术一典型实施例中重组慢病毒对U937细胞的感染率的流式细胞检测图。图2A是本专利技术一典型实施例中感染重组慢病毒的U937细胞分泌的外泌体(bars:100nm)的透射电镜检测图。图2B是本专利技术一典型实施例中外泌体标志蛋白Alix、CD63的western检测图谱。图2C是本专利技术一典型实施例中Hsp16.3、Calnexin蛋白的western检测图谱。图3A是本专利技术一典型实施例中结核分枝杆菌(bars:20μm)的生长形态图。图3B是本专利技术一典型实施例中结核分枝杆菌的抗酸染色鉴定图谱。图4是本专利技术一典型实施例中各样品中的Hsp16.3、Calnexin蛋白的Western检测图谱。图5是本专利技术一典型实施例中健康人、潜伏感染者、结核病人。血浆中的结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白和CD63蛋白的Western检测图谱。具体实施方式如前文所述，鉴于现有技术的不足，为探寻一种能辅助准确诊断结核病的方法，本案专利技术人进行了长期的研究和大量实践，在此过程中，本案专利技术人非常意外的发现，通过检测待检患者血液中的外泌体是否含有结核分枝杆菌的小分子热休克蛋白(Hsp16.3蛋白)，可以将之作为判断结核病患者的辅助诊断依据。基于此意外发现，本案专利技术人得以提出本专利技术的技术方案。如下将予以详细说明。本案专利技术人在研究中首先构建了表达结核分枝杆菌小分子热休克蛋白(Hsp16.3)的一个非整合型慢病毒载体，通过该病毒感染单核巨噬细胞系，使得该细胞系大量表达结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白，证明结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白能被U937细胞包装进外泌体。进一步的，本案专利技术人还利用结核杆菌减毒活菌苗卡介苗BCG感染U937，发现其也能够诱使受到感染的U937细胞分泌含有结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白的外泌体。更进一步的，本案专利技术人通过检测健康人、潜伏感染者、结核病人血浆中的外泌体的情况，发现在结核病人血浆中的外泌体中检测出结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白，而健康人血浆中的外泌体中没有检本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于辅助诊断结核病的试剂盒，其特征在于包括用于检测可能存在于待检患者血液中的外泌体内的Hsp16.3蛋白的物质。

【技术特征摘要】
1.用于辅助诊断结核病的试剂盒，其特征在于包括用于检测可能存在于待检患者血液中的外泌体内的Hsp16.3蛋白的物质。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测Hsp16.3蛋白的物质包括Hsp16.3蛋白的抗体。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括用以提取待检患者血液中外泌体的提取试剂。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括用于鉴定通过所述提取试剂从待检患者血液中提取出的提取物是否为外泌体的鉴定试剂；优选的，所述鉴定试剂包括用于检测CD63蛋白的物质；优选的，所述用于检测CD63蛋白的物质包括CD63蛋白的抗体。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括所述试剂盒的使用方法，所述使用方法包括：(1)提取待检患者血液中的外泌体；(2)检测步骤(1)所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宗德，邵嘉红，黄灿，刘晓玫，陈沁，张春，
申请(专利权)人：昆山仁源生物科技有限公司，北京市结核病胸部肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32