基于凝血酶和凝血因子的双靶点抗凝活性物质的液相色谱‑质谱筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种基于凝血酶和凝血因子的双靶点抗凝活性物质的液相色谱‑质谱筛选方法。具体包括：建立靶标酶酶反应产物的定量方法；获得用于筛选的酶反应溶液；进行高效液相‑质谱联用分析。本发明专利技术保证了所述筛选方法的准确度高、干扰少、灵敏度高和重现性强；质谱方法的自动化进样使得该筛选方法可以连续分析大量的样品，使该方法兼具高通量的特点。该筛选方法，可以用于大批量样品库的筛选，更具实用性，且筛选出的活性物质作用靶点明确，为后续药物的开发奠定了理论基础。本发明专利技术可以降低干扰、特异性高，操作简便、节约时间，有效的提高筛选效率和筛选成功率。

【技术实现步骤摘要】
基于凝血酶和凝血因子的双靶点抗凝活性物质的液相色谱-质谱筛选方法
本专利技术属于药物分析
，具体涉及基于凝血酶和凝血因子的双靶点抗凝活性物质的液相色谱-质谱筛选方法。
技术介绍
酶是机体中重要的药物靶点之一，现有的药物近半数都是小分子酶抑制剂。运用酶靶点筛选抑制剂已有较多研究：有报道将文丘里氏管应用于质谱接口技术，开发了文丘里-常压超声喷雾离子源质谱系统，并将其用于高通量筛选血管紧张素转换酶的抑制剂（Liu,N.,etal.,AnalyticaChimicaActa,2016.913:86-93.）；近几年，酶固定化技术和磁性纳米颗粒结合的方法开发报道也很多，例如采用酶固定化磁珠结合高效液相色谱-紫外检测技术用于筛选GSK-3β的抑制剂（Li,Y.,etal.,JournalofChromatographyA,2015.1425:8-16.）和从药用植物中快速发现α-淀粉酶抑制剂（Li,Y.,etal.,JournalofChromatographyB,2014.960:166-173.）；另外，Kumar等人采用计算机辅助药物设计概念，利用3D形状匹配，静电势相似性评估和分子对接的方法，使用虚拟筛选和骨架转移法筛选具有SUMOE1抑制活性的新颖结构（Kumar,A.,etal.,Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,2016.26(4):1218-1223.）；血红素肽片段具有类似于过氧化酶的活性，在双氧水存在下可以氧化有机分子。基于这个原理，开发了用于胰蛋白酶活性测定和抑制剂筛选的荧光检测方法（Zhang,L.,etal.,Talanta,2016.161:535-540.）；半胱胺封端的CdTe量子点（QDs），其表面的氨基会通过静电作用和氢键作用与加入的ATP相互作用，从而产生明显的荧光增强作用。有学者利用这个现象，开发了用于酸性磷酸酶（ACP）活性测试及其抑制剂的筛选（Wang,J.,etal.,SensorsandActuatorsB:Chemical,2016.234:470-477.）；Morris团队开发荧光生物传感器探测细胞周期蛋白依赖性激酶，并监控了他们在体外和活细胞中含量和活性的变化，以发现新的用于癌症治疗的抑制剂（Prével,C.,etal.,EuropeanJournalofMedicinalChemistry,2014.88:74-88.）；现今，将样品前处理、在线分离和分析等多种技术联合用于筛选酶抑制剂的报道屡见不鲜，既有利用新型样品制备和在线HPLC-DAD-MS/MS-BCD联合分析，快速筛选和表征中药提取物中的特异性α-葡萄糖苷酶抑制剂（LiD.Q.,etal.,JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis2014.88:130–135）；也有通过在线固相萃取和HPLC联用使用紫外检测器测定花生四烯酸，从而筛选细胞溶质磷脂酶A2α的抑制剂（Hanekamp,W.andM.Lehr,JournalofChromatographyB,2012.900:79-84.）；还有通过组合HPLC-HRMS-SPE-NMR方法得到可食用海藻的高分辨率α-葡萄糖苷酶抑制谱，并鉴定了其中的α-葡萄糖苷酶的抑制剂（Liu,B.,etal.,FoodChemistry,2016.203:16-22.）；Zhou等用超滤-高效液相色谱法对茯苓的不同溶剂提取部位进行了β-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选，并对有活性的部位结合高速逆流色谱与SephadexLH-20色谱两种技术进行了进一步的分离纯化，得到了3种抑制活性的化合物，并对其进行了结构解析（Zhou,X.,etal.,JournalofChromatographyB,2015.985:149-154.）。近年来，新兴的纳米微球技术、酶固定化技术、荧光量子点成像技术、表面等离子共振技术和液相-质谱联用技术等被整合起来应用于酶抑制剂筛选，形成一系列新的高效率、高通量的筛选技术。目前公开的文献包括：采用UHPLC-Q-TOF/MS和磁珠偶联法筛选凝血酶抑制剂（Cao,J.,etal.,JournalofChromatographyA,2016.1468:86-94.）；利用基于Au@GS和DNA-CoPdNPs双信号传导的超灵敏的电化学适配体传感器检测凝血酶酶活，并用于抑制剂的筛选（Wang,Y.,etal.,BiosensorsandBioelectronics,2016.80:640-646.）；有文献基于多肽微阵列芯片，采用荧光和共振光散射法测定人血样本中凝血酶抑制剂的抑制活性（Su,M.,etal.,ChineseJournalofAnalyticalChemistry,2015.43(2):199-206.）。上述方法还都仅限于实验室水平的研究，尚未运用到实际生活中。2013年，多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性及筛选凝血酶抑制剂的方法(CN201310282186.X)申请了专利，但该专利使用血浆样本，易受血浆本身特异性的干扰，且前期样品制备时间较长。目前常采用的抗凝药物的筛选技术是光学法和磁珠法。光学法通常包括：比浊法和光谱法（紫外光谱法和荧光光谱法）。比浊法包括散射比浊和透射比浊，相对检验的专一性不强，而且容易受到血浆特异性干扰。光谱法必须保证酶反应体系中有发光物质存在，且该物质的含量变化能灵敏地反应出酶反应的催化过程。现实中的天然底物很多都不具有发光能力，人们通过对其衍生化处理，使其具有发光基团，进而采用光谱法分析。这样本身就破坏了底物的天然状态，不能最真实的反映酶催化情况；其次，前处理相应增加了工作量，衍生化处理及分离等工作耗费大量人力、物力；再次，易受其他发光物质的干扰。在现实应用中，常需要和毛细管电泳和高效液相色谱联用。光谱法虽然可操作性强，准确度高，但其灵敏度低，不宜进行微量分析。磁珠法包括光电探测和电磁探测，利用磁珠在磁场运动产生电信号原理，分别借助光电探测和电信号监测的手段检测磁珠在磁场中的运动规律。该法虽然不受特异血浆的干扰，试剂用量相对少，但是，磁珠的重量、杯壁的光滑程度均对测量造成影响。
技术实现思路
目前抗凝药物筛选方法存在易受特异血浆干扰、样品需要额外衍生和筛选速度慢，易出现假阳性的问题。本专利技术的目的在于克服以上不足，提供了一种高特异性、高灵敏度、高通量和方便快速的基于凝血酶和凝血因子的双靶点抗凝活性物质的液相色谱-质谱筛选方法。本专利技术建立了针对双酶为靶点筛选酶抑制剂的高效液相和质谱法联用方法，避免了样品前期的制备和衍生等不必要的步骤，自动化程度高，操作简单，易于推广。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了基于凝血酶和凝血因子的双靶点抗凝活性物质的液相色谱-质谱筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：（1）配制靶标酶酶反应产物的系列标准溶液，进行高效液相-质谱联用分析，建立靶标酶酶反应产物的定量方法；（2）将凝血酶和凝血因子及其对应的底物与待筛选化合物混合后，得到用于药物筛选的酶反应溶液，30-50℃下反应直至反应完成；去离子水为空白对照；（3）然后进行高效液相-质谱联用分析：测得所本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于凝血酶和凝血因子的双靶点抗凝活性物质的液相色谱‑质谱筛选方法，其特征在于所述筛选方法包括如下步骤：（1）配制靶标酶酶反应产物的系列标准溶液，进行高效液相‑质谱联用分析，建立靶标酶酶反应产物的定量方法；（2）将凝血酶和凝血因子及其对应的底物与待筛选化合物混合后，得到用于药物筛选的酶反应溶液，30‑50 ℃下反应直至反应完成；去离子水为空白对照；（3）然后进行高效液相‑质谱联用分析：测得所述靶标酶酶反应产物的峰面积，以抑制率为评价标准：抑制率=1‑(待筛选化合物的质谱响应峰面积/空白对照的质谱响应峰面积)，筛选出具有抗凝作用的活性物质。

【技术特征摘要】
1.基于凝血酶和凝血因子的双靶点抗凝活性物质的液相色谱-质谱筛选方法，其特征在于所述筛选方法包括如下步骤：（1）配制靶标酶酶反应产物的系列标准溶液，进行高效液相-质谱联用分析，建立靶标酶酶反应产物的定量方法；（2）将凝血酶和凝血因子及其对应的底物与待筛选化合物混合后，得到用于药物筛选的酶反应溶液，30-50℃下反应直至反应完成；去离子水为空白对照；（3）然后进行高效液相-质谱联用分析：测得所述靶标酶酶反应产物的峰面积，以抑制率为评价标准：抑制率=1-(待筛选化合物的质谱响应峰面积/空白对照的质谱响应峰面积)，筛选出具有抗凝作用的活性物质。2.根据权利要求1所述的双靶点抗凝活性物质的液相色谱-质谱筛选方法，其特征在于：所述步骤（1）中靶标酶酶反应产物为对硝基苯胺和7-胺基-4-甲基香豆素。3.根据权利要求1所述的双靶点抗凝活性物质的液相色谱-质谱筛选方法，其特征在于：所述步骤（2）和（3）之间还设有步骤：对用于药物筛选的经酶反应后的溶液进行样品分离纯化。4.根据权利要求3所述的双靶点抗凝活性物质的液相色谱-质谱筛选方法，其特征在于：所述分离纯化依次包括除蛋白和除盐步骤。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：许哲，刘若男，管华诗，
申请(专利权)人：青岛海洋生物医药研究院股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37