结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒及引物、探针制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测，具体涉及一种结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、探针。该引物和探针根据结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列设计，包括具有SEQ NO.2所示碱基序列的正向引物、具有SEQ NO.3所示碱基序列的反向引物和具有SEQ NO.4所示序列的探针。采用本发明专利技术提供的引物、探针对结核分枝杆菌进行检测能够具有良好的准确性、特异性和灵敏度。经实验证实，本发明专利技术提供引物、探针的准确性可达100％，特异性良好，最低检测浓度为1.00×10

【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒及引物、探针
本专利技术属于生物
中细菌的分子生物学检测，具体涉及一种结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、探针。
技术介绍
结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的一种慢性人畜共患病，能够感染人和多种哺乳动物以及禽类。其中导致人类感染的结核菌大多数是人结核分枝杆菌，也有10％以上是由牛分枝杆菌引起的。各个器官都可以被侵染，但以肺器官被侵染为多见，侵染结核分枝杆菌的组织和器官会形成肉芽肿和干酪样、钙化结节病变。结核病是一种危害严重的慢性传染病，全球有约20亿人被感染，每年新增结核病患者达800-1000万，每年因结核病死亡人数为200-300万，死于结核病的成年人多于艾滋病、疟疾和热带病死亡人数的总和。我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患病人数居世界第2位。当今结核病疫情呈现“六多”的特点：感染人数多，患病人数多，新发患者多，死亡人数多，农村患者多和耐药患者多。在我国，有450万活动性肺结核患者，其中痰AFB阳性者130万，每年因结核病死亡的人数30万。至2003年以来，肺结核经常占据国家CDC法定传染病(除艾滋病外)的首位。2012年全国肺结核病报告新增患者位居乙肝之后，新发生病例95万人，其中死亡2662例。结核病防治作为我国乃至全球疾病防治的重要课题，如何提供敏感、特异、快速、可靠、简便和适合临床的实验室检查技术是国内外研究重点。目前，临床上应用的结核性分枝杆菌的检测方法包括涂片测试、培养测试和分子诊断测试等。涂片测试通过Ziehl-Neelsen染色确定耐酸性，虽然可简单快速的获得结果，但是检测敏感度仅为45％-80％；培养测试是诊断结核病的金标准，该方法对实验室的生物安全级别要求很高，在资源匮乏的国家或地区尚不能普及，此外，由于MTB生长缓慢导致MTB培养所需时间较长(4-8周)，仅采用MTB培养诊断结核病可能延误治疗，难以满足临床需求。近年来作为直接检测分枝杆菌、种系鉴定和药敏实验的许多分子生物学方法得到长足发展，其中实时荧光定量PCR技术由于具备较高的灵敏度和特异性，已逐渐应用于临床。并且利用荧光定量PCR技术使定性检测迈上了可以量化的台阶，达到实时检测、绝对定量和快速检测的目的，它与核酸分子杂交等技术一起领导着基因诊断的发展趋势，目前已经广泛应用于临床检验的多项指标中。开发结核分枝杆菌的荧光定量PCR试剂盒，将能定量检测结核分枝杆菌DNA的拷贝数，不但可以为临床提供更准确和有价值的诊断信息，还可以为临床上的疗效观察、用药剂量和用药时间等提供依据。由美国Cepheid公司开发基于实时荧光定量PCR技术的XpertMTB/RIF检测方法，可以实现快速的检测诊断结核分枝杆菌以及利福平耐药情况，目前该检测方法检测成本比较贵，在发展中国家尚未推广使用。国内市场上存在的有利用Roche公司Taqman探针技术开发的荧光定量PCR诊断试剂盒，但在特异性检测上尚存在缺陷，因此，开发一种具有较高诊断灵敏度和特异性的试剂盒，是目前亟待解决的重要问题。
技术实现思路
为此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种简单方便的、高灵敏性、特异性和准确性的结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒。本专利技术提供了一种基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的引物，所述引物为根据结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列设计，所述结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列如序列表中SEQNO.1所示。所述groEL2基因在GeneBank中的GeneID为：886354。优选的，所述引物包括正向引物groEL2-F和反向引物groEL2-R，所述正向引物groEL2-F碱基序列如序列表中SEQNO.2所示，所述反向引物groEL2-R碱基序列如序列表中SEQNO.3所示。所述的引物扩增的目的片段的大小为134bp。本专利技术提供了基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的探针，所述探针为根据结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列设计，所述结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列如序列表中SEQNO.1所示。优选的，所述探针groEL2-P序列如序列表中SEQNO.4所示，所述探针groEL2-P的5’端连接有荧光物质，3’端连接有淬灭物质优选的，所述荧光物质为FAM，所述淬灭物质为TAMRA。本专利技术提供了一种用于对结核分枝杆菌进行荧光定量PCR检测的试剂盒，包括所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的引物和/或所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的探针。所述的试剂盒，包括荧光定量PCR扩增体系混合物：2×Taqmanmix，10μL；groEL2-F，5μmol，1μL；groEL2-R，5μmol，1μL；groEL2-P，5μmol，1μL；Taq酶，0.3μL；ddH2O，5.7μL。所述的试剂盒，荧光定量PCR扩增反应程序设定如下：94℃预变性2分钟，94℃保持15秒，60℃保持40s并收集荧光信号，40个循环。所述的试剂盒，还包括结核分枝杆菌阳性定量参考品和阴性对照、临界阳性对照以及强阳性对照。所述的试剂盒，以具有groEL2基因保守序列片段的pMD18-T-groEL2质粒为标准品，采用基因克隆技术，将结核分枝杆菌groEL2基因的保守片段插入到载体pMD18-T中，获得含有groEL2基因片段的重组质粒pMD18-T-GroEL2，以此作为标准品。所述groEL2基因片段的获得方法为：提取结核分枝杆菌(标准菌株)的基因组DNA作为模板，用所述正向引物groEL2-F和反向引物groEL2-R进行扩增，所得扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后得到目的片段。所述的试剂盒，所述阳性定量参考品为上述pMD18-T-groEL2质粒标准品按照10倍梯度进行稀释，选取拷贝数为1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml和1.00×104copies/ml的质粒作为所述阳性定量参考品；阴性对照：双蒸水；强阳性对照：拷贝数为107-108copies/ml的pMD18-T-groEL2质粒；临界阳性对照：拷贝数为103-104copies/ml的pMD18-T-groEL2质粒。质粒拷贝数copies/ml＝质粒浓度g/ml×6.02×1023copies/mol÷(质粒所含碱基数×660g/bp·mol)。优选的，荧光定量PCR扩增反应条件：94℃预变性2分钟，94℃保持15秒，60℃保持40s并收集荧光信号，40个循环。本专利技术提供一种对结核分枝杆菌的检测方法，使用本专利技术提供的试剂盒对待测样品的基因组DNA为模板进行荧光定量PCR检测，荧光定量PCR扩增反应程序如下：94℃预变性2分钟，94℃保持15秒，60℃保持40s并收集荧光信号，40个循环。优选的，所述基因组DNA的加入量1μL。所述的对结核分枝杆菌的检测方法，通过荧光定量PCR检测可同时得到样品的Ct值以及扩增曲线，若所述扩增曲线呈现S型且Ct≤31，判定结果为结核分枝杆菌阳性；若无Ct值或者Ct值>35，则判定结果为结核分枝杆菌阴性；若31<Ct≤35，则此本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的引物，其特征在于，所述引物为根据结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列设计，所述结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列如序列表中SEQ NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的引物，其特征在于，所述引物为根据结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列设计，所述结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列如序列表中SEQNO.1所示。2.根据权利要求1所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的引物，其特征在于，所述引物包括正向引物groEL2-F和反向引物groEL2-R，所述正向引物groEL2-F碱基序列如序列表中SEQNO.2所示，所述反向引物groEL2-R碱基序列如序列表中SEQNO.3所示。3.基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的探针，其特征在于，所述探针为根据结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列设计，所述结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列如序列表中SEQNO.1所示。4.根据权利要求3所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的探针，其特征在于，所述探针groEL2-P序列如序列表中SEQNO.4所示，所述探针groEL2-P的5’端连接有荧光物质，3’端连接有淬灭物质。5.根据权利要求4所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的探针，其特征在于，所述荧光物质为FAM，所述淬灭物质为TAMRA。6.一种用于对结核分枝杆菌进行荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，同重湘，尤崇革，谢小冬，李琳，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32