葡萄糖1-磷酸的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种葡萄糖1-磷酸的制备方法，属于葡萄糖1-磷酸的酶催化制备领域。本发明专利技术所公开的葡萄糖1-磷酸的制备方法以淀粉或淀粉的衍生物为底物，在一个多酶反应体系中，通过无细胞多酶高效催化将底物转化为葡萄糖1-磷酸；本发明专利技术通过过程优化，添加能够促进淀粉水解的酶以及利用副产物麦芽糖的酶，从而建立多酶反应体系，显著提升了原料的转化效率和葡萄糖1-磷酸的产率。本发明专利技术方法原料转化率高，葡萄糖1-磷酸产率高，步骤简捷，生产成本低，对环境影响小，可实现葡萄糖1-磷酸的规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
葡萄糖1-磷酸的制备方法
本专利技术涉及葡萄糖1-磷酸的制备方法，尤其涉及无细胞多酶催化将淀粉以及淀粉衍生物转化为葡萄糖1-磷酸的方法，属于葡萄糖1-磷酸的酶催化生产领域。
技术介绍
在生物体中，葡萄糖1-磷酸(G1-P)是通过葡聚糖磷酸化酶催化糖原，淀粉或者麦芽糊精等多糖和无机磷酸盐反应产生的，它是糖异生途径的第一个代谢物，可以在葡萄糖磷酸变位酶(PGM，EC5.4.2.2)的作用下生成葡萄糖-6-磷酸，进入糖酵解或者其他代谢途径。作为一种活化葡萄糖，G1-P在复合糖化合物（比如糖脂，寡糖，糖核苷酸）的合成中是一种重要的前体。此外，该化合物还可以用于合成人工淀粉，通过生物糖电池产生电力，以及高得率产氢。据报道，G1-P具有抗炎以及免疫抑制治疗效果，其钙盐具有抗癌作用，因此，G1-P还具有潜在的医疗应用价值。迄今为止，葡萄糖1-磷酸的应用仍未得到充分发掘，这可能缘于其过高的生产成本。由于葡萄糖1-磷酸具有很高的极性，很难通过完整的细胞膜，葡萄糖1-磷酸通常是通过多糖磷酸化酶催化相应的二糖、寡糖或者多糖得到的。然而，过去单纯使用多糖磷酸化酶催化生产葡萄糖1-磷酸的方法具有很多不足。比如说，以二糖（蔗糖，海藻糖或者纤维二糖）作为底物时，首先二糖的价格可能远高于淀粉，以蔗糖为例，其以葡萄糖计算的葡萄糖1-磷酸的理论最大得率只有50%，同时生产过程中会伴随着果糖的产生，造成分离成本很高。虽然麦芽糊精以及淀粉的成本比二糖低，但是底物中α-1，6糖苷键的存在导致葡聚糖磷酸化酶不能与底物充分反应，同时葡聚糖磷酸化酶的底物选择倾向于麦芽四糖或者更长的寡糖，麦芽糖以及葡萄糖不能作为葡聚糖磷酸化酶的底物，这些原因都会导致以麦芽糊精或者淀粉作为底物时，产品得率低。比如Weinhausel于1995年以40g/L麦芽糊精作为底物，使用来源于Corynebacteriumcallunae的葡聚糖磷酸化酶催化生产葡萄糖1-磷酸的产量为65mM，转化率仅为49%（该转化率为无水葡萄糖1-磷酸二钠相对于淀粉的质量转化率，下同），Bae于2005年以50g/L可溶性淀粉作为底物，使用来源于ThermuscaldophilusGK24葡聚糖磷酸化酶生产葡萄糖1-磷酸的产量为132mM，转化率为80%。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种葡萄糖1-磷酸的酶催化转化方法，通过无细胞多酶催化淀粉以及淀粉的衍生物生产葡萄糖1-磷酸的方法，该方法具有葡萄糖1-磷酸产率和转化率高，生产成本低等优点。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了一种葡萄糖1-磷酸的制备方法，包括以下步骤：（1）以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入分支酶，葡聚糖磷酸化酶（α-Glucanphosphorylase，EC2.4.1.1），葡聚糖转移酶（4-a-glucanotransferase，EC2.4.1.25）或者麦芽糖磷酸化酶（maltosephosphorylase，EC2.4.1.8）建立多酶反应体系，进行酶催化反应；（2）将反应产物进行分离、纯化，即得。其中，步骤（1）所述底物的浓度为10g/L；所述去分支酶为异淀粉酶（isoamylase，EC3.2.1.68）或普鲁兰酶（pullulanase，EC3.2.1.41）中的任意一种或两种，所述葡聚糖磷酸化酶的用量为0.05U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶（maltosephosphorylase，EC2.4.1.8）或葡聚糖转移酶（EC2.4.1.25）的用量为1U/mL，所述酶催化反应的条件是在20-90℃反应2-100小时；优选为，在70℃反应40小时。更优选的，所述底物的浓度为10g/L；所述葡聚糖磷酸化酶的用量为5U/mL，所述淀粉去分支酶的用量为1U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶的用量为1U/mL；所述酶催化反应在20-100℃反应2-100小时；优选的，所述酶催化反应在20-90℃反应40小时；最优选的，所述酶催化反应在70℃反应40小时。所述多酶反应体系还含有以下各成分：磷酸缓冲液、二价镁离子；优选的，各成分的用量为：磷酸盐200mM，二价镁离子5mM；其中，所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液，更优选的，缓冲液的pH值7.2。反应结束后，残余的淀粉残渣将是低分叉淀粉，此时可加入少量的α淀粉酶（EC3.2.1.1）促进淀粉残渣的水解，进一步提高葡萄糖1-磷酸的得率。优选的α淀粉酶的用量为0.1U/ml。本专利技术以淀粉或淀粉衍生物为底物，以葡聚糖磷酸化酶作为反应核心酶，通过添加分支酶，葡聚糖转移酶（EC2.4.1.25）或者麦芽糖磷酸化酶（maltosephosphorylase，EC2.4.1.8）建立高得率的葡萄糖1-磷酸反应体系，而高得率可以大大降低最终葡萄糖1-磷酸的分离成本。由于淀粉是直链淀粉和支链淀粉的混合物。支链淀粉中的支链是以α-1,6糖苷键与主链相连的，而葡聚糖磷酸化酶并不能分解α-1,6糖苷键。为了提高葡萄糖1-磷酸的转化率，本专利技术在多酶反应体系中加入了能够分解淀粉中α-1,6糖苷键的去分支酶—异淀粉酶或普鲁兰酶。由于葡聚糖磷酸化酶水解淀粉的最终产物是麦芽糖，为了利用麦芽糖，本专利技术还在反应体系中加入（4-a-glucanotransferase，EC2.4.1.25），该酶可以将短链的寡聚糖聚合成为长链的寡聚糖，而该长链的寡聚糖又可被葡聚糖磷酸化酶重新利用，从而能够提高淀粉的利用率。将麦芽糖分解为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖；在这里，葡聚糖转移酶可部分被麦芽糖磷酸化酶替换。本专利技术所述淀粉及淀粉衍生物包括未水解淀粉，部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种。本专利技术多酶反应体系中的任何一种酶还可以为任何一种具有同等功能的酶所替换，优选为通过蛋白质工程改造所获得的具有同等功能的突变酶。本专利技术体外多酶催化将淀粉转化为葡萄糖1-磷酸试验中，在一个反应体系中，以可溶性淀粉为原料，加入葡聚糖磷酸化酶，最终葡萄糖1-磷酸的转化率为67%。在上述反应体系中另外加入异淀粉酶，葡聚糖转移酶，同时提高葡聚糖磷酸化酶的用量，最终葡萄糖1-磷酸的转化率达到114%，转化率显著提高。本专利技术技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：本专利技术在一个多酶反应体系中，以淀粉以及它们的衍生物为原料，通过体外多酶催化转化为葡萄糖1-磷酸，并通过过程优化，添加能促进淀粉水解的酶以及利用副产物（麦芽糖）的酶，使转化效率显著提高，高得率降低葡萄糖1-磷酸的分离成本。本专利技术方法具有简便，原料利用率高、葡萄糖1-磷酸产率高，生产成本低，等优点，可以实现葡萄糖1-磷酸的规模化生产。本专利技术所涉及到的术语及定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。术语“葡萄糖多聚物”意指葡萄糖分子聚合而成的未水解淀粉。术语“葡萄糖寡聚物”意指部分水解的淀粉、淀粉糊精、麦芽多糖、麦芽糖等。文中所涉及的转化率为葡萄糖1-磷酸二钠（无水）相对于淀粉的质量转化率（w/w*100%）附图说明图1为转化淀粉生成葡萄糖1-磷酸的无细胞多酶催化途径1的示意图；其中，IA，异淀粉酶；PA，普本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄糖1‑磷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入葡聚糖磷酸化酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应；（2）将反应产物进行分离、纯化，即得。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖1-磷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入葡聚糖磷酸化酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应；（2）将反应产物进行分离、纯化，即得。2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述多酶反应体系中还含有淀粉去分支酶，葡聚糖转移酶，其中葡聚糖转移酶可被麦芽糖磷酸化酶部分替换，所述淀粉去分支酶为异淀粉酶或普鲁兰酶中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张以恒，周伟，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12