一种骚动厄斯考维菌及在制备(R)‑3‑氯苯乙醇中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种骚动厄斯考维菌及在制备(R)‑3‑氯苯乙醇中的应用，采用该新菌种催化制备光学纯(R)‑3‑氯苯乙醇具有底物浓度高，立体选择性好，产物光学纯度高等优点。本发明专利技术通过采用骚动厄斯考维菌(Oerskovia turbata)ZJPH1604细胞为催化剂的手性生物催化，当底物浓度为80mmol/L时，目的产物(R)‑3‑氯苯乙醇的e.e达到99.9％，产率达到98.1％。

【技术实现步骤摘要】
一种骚动厄斯考维菌及在制备(R)-3-氯苯乙醇中的应用(一)
本专利技术涉及一株可用于生物催化不对称还原3-氯苯乙酮制备高光学纯度(R)-3-氯苯乙醇的新菌种——骚动厄斯考维菌(Oerskoviaturbata)ZJPH1604及其应用。(二)
技术介绍
(R)-3-氯苯乙醇的化学结构式为：(R)-3-氯苯乙醇是一种重要的手性中间体，是多种药物分子的构建模块，例如，它可以用于合成治疗脊髓型肌肉萎缩症的活性化合物(R)-5-[1-(3-氯苯基)乙氧基]喹唑啉-2,4-二胺，还可以用于合成治疗抑郁症、糖尿病和肥胖的β3-肾上腺素受体激动剂，包括SR58611，Solabegron，CL316243，AJ-9677等。采用化学法制备(R)-3-氯苯乙醇，需要使用价格昂贵的如铑、钌等金属催化剂，会对环境造成污染。采用微生物全细胞催化的生物不对称还原方法制备(R)-3-氯苯乙醇具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点。已有文献报道，JohnThurmond等(J.Med.Chem.2008,51,449–469)利用手性催化剂((S)-MeCBS和(R)-MeCBS)催化还原3-氯苯乙酮制备(R)-3-氯苯乙醇，Perna等(J.ofMol.Catal.B:Enzym.,2016,124:29–37)利用Lactobacillusreuteri静息细胞催化还原3-氯苯乙酮制备(R)-3-氯苯乙醇，转化率100％，对映体过量值(ee)>99％，当底物浓度>5g/L时，转化率低于70％。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株可用于生物催化不对称还原3-氯苯乙酮制备高光学纯度(R)-3-氯苯乙醇的微生物新菌种——骚动厄斯考维菌(Oerskoviaturbata)ZJPH1604，以及该菌种在催化不对称合成制备(R)-3-氯苯乙醇中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新菌株--骚动厄斯考维菌(Oerskoviaturbata)ZJPH1604，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：M2016541，保藏日期：2016年9月30日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。本专利技术还提供一种所述骚动厄斯考维菌ZJPH1604在微生物催化不对称还原3-氯苯乙酮制备(R)-3-氯苯乙醇中的应用，具体所述应用为：以3-氯苯乙酮为底物，以骚动厄斯考维菌ZJPH1604经发酵培养获得的湿菌体细胞为酶源，加入辅助底物，于pH为6.0～9.0的缓冲液中，在25～35℃下进行转化反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到(R)-3-氯苯乙醇；所述辅助底物为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、异丙醇、甲醇或乙醇中的一种。进一步，所述底物3-氯苯乙酮的初始浓度为20～200mmol/L缓冲液(优选25-150mmol/L)，骚动厄斯考维菌ZJPH1604湿菌体细胞的添加量以湿重计为50～300g/L缓冲液(优选100-300g/L)；所述辅助底物为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖时，加入量为20～300g/L缓冲液(优选100-300g/L)，所述辅助底物为甲醇、乙醇或异丙醇时，加入体积为缓冲液体积的10～30％(优选20％)。进一步，所述酶源按如下方法制备：1)斜面培养：将骚动厄斯考维菌ZJPH1604接种至斜面培养基中，30℃培养1-2天，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏4g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO41g/L，NaCl0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH6.5；2)种子培养：从斜面挑一环菌体接入装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200r/min培养24小时，获得种子液；所述种子培养基组成为：葡萄糖10-20g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母膏4-8g/L，(NH4)2SO42-4g/L，KH2PO42-4g/L，NaCl0.5-2g/L，MgSO4·7H2O0.5-2g/L，溶剂为水，pH6.5-8.0；优选所述种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏4g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO42g/L，NaCl0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，溶剂为水，pH6.5；3)发酵培养：以体积浓度4-10％(优选8％)的接种量将种子液转接到装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，180-220r/min(优选200r/min)培养36-48h(优选48h)，将发酵液离心，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖20～30g/L，酵母膏10～40g/L，(NH4)2SO41.0-6.0g/L，KH2PO42.0～6.0g/L，MgSO4·7H2O0.3～0.6g/L，NaCl0.2～0.8g/L，溶剂为水，pH6.0～7.5，优选所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖15g/L，酵母膏30g/L，(NH4)2SO42.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O0.6g/L，NaCl0.4g/L，溶剂为水，pH6.5。采用Box-Behnken旋转中心组合实验设计法对葡萄糖浓度、酵母膏浓度和KH2PO4浓度三个对产酶影响显著的因素进行优化，得到骚动厄斯考维菌(Oerskovia)ZJPH1604。菌株的优化培养基组成为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏10～40g/L，(NH4)2SO41.0-6.0g/L，KH2PO42.0～6.0g/L，MgSO4·7H2O0.3～0.6g/L，NaCl0.2～0.8g/L，溶剂为水，pH6.0～7.5。骚动厄斯考维菌(Oerskovia)ZJPH1604的培养条件为：初始pH6.0～7.5，摇瓶装液量80～120mL/250mL锥形瓶，培养温度30℃、摇床转速180～220rpm，接种量4～10％，培养时间36～48h。本专利技术所述反应液分离纯化方法为：反应结束后，将转化液用等体积乙酸乙酯萃取，经离心后得到上清液，采用手性气相色谱法分析目的产物和残留底物的含量，以及产物的光学纯度。本专利技术优选所述辅助底物为异丙醇，此时所得产物的光学纯度和产率最高。本专利技术从土样中筛选获得了与以往同类研究报道不同的微生物新菌种，并且催化转化的底物浓度和产率均较高，从而在研究微生物催化法制备手性中间体(R)-3-氯苯乙醇方面提供了有益的参考。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了一株可用于微生物催化不对称还原3-氯苯乙酮制备(R)-3-氯苯乙醇的微生物新菌种，采用该新菌种催化制备光学纯(R)-3-氯苯乙醇具有底物浓度高，立体选择性好，产物光学纯度高等优点。本专利技术通过采用骚动厄斯考维菌(Oerskoviaturbata)ZJPH1604细胞为催化剂的手性生物催化，当底物浓度为80mmol/L时，目的产物(R)-3-氯苯乙醇的e.e达到99.9％，产率达到98.1％。(四)附图说明图1为底物标准品气相色谱图(含内标十二烷)；图2为消旋体产物标准品气相色谱图(含内标十二烷)；图3为骚动厄斯考维菌(Oerskoviaturbata)ZJPH1604菌株生物还原反应萃取液气相色谱图(含内标十二烷)。(五)具体实施方式下面结合具本文档来自技高网...

【技术保护点】
骚动厄斯考维菌(Oerskovia turbata)ZJPH1604，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2016541，保藏日期：2016年9月30日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。

【技术特征摘要】
1.骚动厄斯考维菌(Oerskoviaturbata)ZJPH1604，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：M2016541，保藏日期：2016年9月30日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。2.一种权利要求1所述骚动厄斯考维菌ZJPH1604在微生物催化不对称还原3-氯苯乙酮制备(R)-3-氯苯乙醇中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以3-氯苯乙酮为底物，以骚动厄斯考维菌ZJPH1604经发酵培养获得的湿菌体细胞为酶源，加入辅助底物，于pH为6.0～9.0的缓冲液中，在25℃～35℃下进行转化反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到(R)-3-氯苯乙醇；所述辅助底物为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、异丙醇、甲醇或乙醇中的一种。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物3-氯苯乙酮的初始浓度为20～200mmol/L缓冲液，骚动厄斯考维菌ZJPH1604湿菌体细胞的添加量以湿重计为50～300g/L缓冲液；所述辅助底物为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖时，加入量为20～300g/L缓冲液，所述辅助底物为甲醇、乙醇或异丙醇时，加入体积为缓冲液体积的10～30％。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备：1)斜面培养：将骚动...

【专利技术属性】
技术研发人员：何军邀，王普，白东亚，
申请(专利权)人：浙江医药高等专科学校，浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33