检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒及反应体系制造技术

本发明专利技术公开了一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒及反应体系，该试剂盒包括：上游引物、下游引物、检测外显子19缺失突变的荧光探针和检测扩增后总DNA的荧光探针。该试剂盒针对EGFR基因外显子19缺失突变设计了特定序列的引物对和特定序列的探针，在优化的反应体系中通过digital PCR平台的方法，实现对EGFR基因外显子19缺失突变的高灵敏度检测，另外该检测可以同时检测18种不同类型的EGFR基因外显子19缺失形式，大大提高了通用性，从而为EGFR靶向治疗提供参考；进一步的本申请中可检测的样本来源多样，既可以是肿瘤组织，也可以是ctDNA，扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围。

Kit and reaction system for detecting exon 19 deletion mutation of human EGFR gene

The invention discloses a kit for detecting human EGFR gene exon 19 deletion mutation and reaction system, the kit includes: fluorescence probe and detection of upstream primer and downstream primer, detection of deletion mutation in exon 19 of total amplified DNA. The primer Probe Kit for EGFR gene exon 19 deletion mutation specific sequences and to design specific sequences, digital PCR platform through the optimized reaction system, achieve the high sensitivity detection of EGFR gene exon 19 deletion mutation, and the detection can detect 18 different types the EGFR gene exon 19 deletion form, greatly improve the versatility, so as to provide reference for EGFR targeted therapy; further this application can detect the sample sources can be both tumor tissue, can also be ctDNA, expand the scope of the use of the kit, the reaction system and method.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测基因突变的试剂盒、反应体系及方法，特别涉及一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒、反应体系及方法。
技术介绍
一直以来肺癌都位居全球癌症相关死亡的首位。世界卫生组织国际癌症研究署发布的癌症报告显示：全球肺癌新发病例预测约161万例，死亡约138万例，分别占恶性肿瘤新发病例及死亡病例的13％及18％，居恶性肿瘤第一位，其中非小细胞肺癌(Non-SmallCellLungCancer，NSCLC)占肺癌的80％以上。尽管肺癌的诊断方法和治疗手段不断提高，肺癌的死亡率仍未得到有效控制，患者的预后较差，5年生存率仍<20％。人类表皮生长因子受体家族(epidermalgrowthfactorreceptorfamily,EGFR家族)属于酪氨酸激酶受体家族，是一种多功能糖蛋白，其广泛分布于人体各组织细胞膜上，是原癌基因的表达产物，其基因位于第七号染色体短臂上(7p12)，由188.307K个碱基组成，共有28个外显子，EGFR具有酪氨酸激酶(tyrosinekinase,TK)区，其是传递胞外信号到胞内的重要途经蛋白，并由外显子18.24编码。EGFR家族成员的结构相似，都包括胞外段、跨膜区和胞内段三部分。胞外段为受体与配体结合部，跨膜段为疏水部，将受体固定于细胞膜上，胞内区有典型的ATP结合位点和酪氨酸激酶区，其酪氨酸激酶活性在调节细胞增殖及分化中起着至关重要的作用。当配体与受体结合后，引起受体的二聚化作用，形成同型或异型二聚体，二聚化的受体发生交联磷酸化，即一个受体和另外一个受体上特定的酪氨酸残基磷酸化，激活胞内区的TK亚区，从而激发下一级信号传导。非小细胞肺癌EGFR突变85％以上发生在外显子19的缺失突变及外显子21的L858R点突变。近年来，表皮细胞生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制物(TKIs)吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼等被证明对具有EGFR激活突变的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者具有显著疗效，EGFR-TKI成为非小细胞肺癌治疗的里程碑。但同时，几乎所有初始时对EGFR-TKI反应良好的患者会在6-12个月内出现耐药、疾病进展，称为“获得性耐药”。许多研究已证实EGFR的突变状态决定了肿瘤对EGFR-TKI的反应，研究表明EGFR-TKI药物对于EGFRL858R和EGFR外显子19缺失突变的患者作用显著，尤其是EGFR基因外显子19发生缺失突变的非小细胞肺癌患者对该类药物敏感，即受体酪氨酸激酶抑制剂药物对这些患者有疗效。因此EGFR外显子exon19缺失突变准确的检测，可以为筛选靶向治疗患者提供参考；同时可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。但外显子19缺失突变主要是发生9、12、15、18、24个核苷酸的框内缺失突变，其缺失形式较多，为检测其缺失情况带来一定困难。目前检测EGFR基因突变最常用的样本来源是肿瘤的病理组织或细胞学标本，但是组织取材均为有创操作，有时难以实施，且这些操作受肿瘤大小、部位、患者一般情况等影响，有时不能取得满意的组织或组织量太少不能进行基因突变检测。并且随着疾病的进展和EGFR-TKIs耐药性的出现，常常需要再次进行分子生物学检测，而组织取材为有创操作，不能便捷、反复进行。近些年血浆游离DNA(ctDNA)被认为是一种可能代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本。肿瘤组织、肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释放游离DNA进入外周血。ctDNA用于肿瘤突变检测优势在于：操作无创；在疾病的任一进程中都可获取；可以作为一种肿瘤标记物，实现实时检测和动态监测；克服肿瘤组织的异质性。因此，使用外周血游离DNA监测患者EGFR基因突变状态，探索患者EGFR-TKI耐药机制及预测预后成为一条可行的途径。然而，目前使用ctDNA检测EGFR基因突变仍有一些技术上的挑战。1)ctDNA含量因人而异，并且大多数人含量较低；2)ctDNA片段相对小，约为180bp：3)ctDNA中肿瘤相关的DNA所占比例不同人差别较大，并且常因比例小而难以测出；4)以前的研究显示，与肿瘤组织相比，ctDNA检测EGFR突变灵敏度仅为43-66％。因此，高灵敏度的ctDNAEGFR基因突变检测技术的发展十分重要。综上所述，本领域迫切需要一种能够基于非肿瘤组织，高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中EGFR外显子19缺失突变的方法。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒、反应体系及方法，该试剂盒针对EGFR基因外显子19缺失突变设计了特定序列的引物对和特定序列的探针，在优化的反应体系中通过ThermoQuantStudio3DdigitalPCR平台的方法，实现对EGFR基因外显子19缺失突变的高灵敏度检测；并且在检测EGFR基因外显子19缺失突变的阴阳性的同时还可以获得样本中EGFR基因外显子19缺失突变的比例；另外该检测可以同时检测18种不同类型的EGFR基因外显子19缺失形式，大大提高了通用性，从而为EGFR靶向治疗提供参考；进一步的本申请中可检测的样本来源多样，既可以是肿瘤组织，也可以是ctDNA，扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围。本专利技术的具体技术方案如下：一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒，包括：具有如SEQIDNO:1所示序列的上游引物、具有如SEQIDNO:2所示序列的下游引物、具有如SEQIDNO:3所示序列的检测外显子19缺失突变的荧光探针和具有如SEQIDNO:4所示序列的检测扩增后总DNA的荧光探针。上游引物SEQIDNO:1的序列为GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT，下游引物SEQIDNO:2的序列为AGCAGAAACTCACATCGAGG。检测外显子19缺失突变的荧光探针序列SEQIDNO:3为TCCTTGTTGGCTTTC，检测扩增后总DNA的荧光探针序列SEQIDNO:4为AGGAATTAAGAGAAGCAAC。检测外显子19缺失突变的荧光探针5’端连接有荧光报告基团，优选为VIC，检测外显子19缺失突变的荧光探针3’端连接有淬灭基团，优选为MGB；检测扩增后总DNA的荧光探针5’端连接有荧光报告基团，且该荧光报告基团不同于检测外显子19缺失突变的荧光探针中的荧光报告基团，优选为FAM,检测扩增后总DNA的荧光探针3’端连接有淬灭接团，优选为MGB。上述试剂盒在另一种实现方式中，所述上游引物、下游引物、检测外显子19缺失突变的荧光探针和检测扩增后总DNA的荧光探针均以引物探针混合液的形式存在，即所述上游引物、下游引物、检测外显子19缺失突变的荧光探针和检测扩增后总DNA的荧光探针均溶解在同一TE缓冲液中，所述上游引物在引物探针混合液中的浓度为12μM，所述下游引物在引物探针混合液中的浓度为12μM，所述检测外显子19缺失突变的荧光探针在引物探针混合液中的浓度为3μM，所述检测扩增后总DNA的荧光探针在引物探针混合液中的浓度为3μM。上述试剂盒在另一种实现方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，包括：具有如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、具有如SEQ ID NO:3所示序列的检测外显子19缺失突变的荧光探针和具有如SEQ ID NO:4所示序列的检测扩增后总DNA的荧光探针。

【技术特征摘要】
1.一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，包括：具有如SEQIDNO:1所示序列的上游引物、具有如SEQIDNO:2所示序列的下游引物、具有如SEQIDNO:3所示序列的检测外显子19缺失突变的荧光探针和具有如SEQIDNO:4所示序列的检测扩增后总DNA的荧光探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物、检测外显子19缺失突变的荧光探针和检测扩增后总DNA的荧光探针均存在于引物探针混合液中。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物在引物探针混合液中的浓度为12μM，所述下游引物在引物探针混合液中的浓度为12μM，所述检测外显子19缺失突变的荧光探针在引物探针混合液中的浓度为3μM，所述检测扩增后总DNA的荧光探针在引物探针混合液中的浓度为3μM。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括数字PCR反应预混液，优选QuantStudioTM3DDigitalPCRMasterMixv2。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性质控品，所述阳性质控品通过以下方式制备获得：将EGFR基因外显子19缺失突变细胞系基因组DNA与野生型细胞系基因组DNA混合后使含EGFR基因外显子19缺失突变的DNA比例占总DNA的约1.0％，将所得混合DNA加到Covaris超声管中并进行超声处理，获得打断成为与...

【专利技术属性】
技术研发人员：阎海，王思振，焦宇辰，郑延军，徐大勇，郑乔松，
申请(专利权)人：北京泛生子基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11