本发明专利技术涉及医药技术领域，具体为从海洋动物厚壳贻贝中分离到的一种具有增强免疫和抗肿瘤活性的新的多糖成分ＭＦ４，其相对分子量为１１３，０００。采用多种波谱手段（ＵＶ、ＩＲ、ＧＣ／ＭＳ、［１］↑ＨＮＭＲ）和化学方法（水解，乙酰化，过碘酸氧化，Ｓｍｉｔｈ降解，甲基化，硫酸－咔唑反应等）对其理化性质和化学结构进行了分析鉴定。体外实验证明ＭＦ４可显著的促进Ｔ、Ｂ淋巴细胞的增殖；体内抗肿瘤实验表明，可明显抑制皮下接种的小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌和Ｓ－１８０肉瘤的生长，而且对荷Ｌｅｗｉｓ肺癌小鼠的ＮＫ细胞的活性和淋巴细胞的转化有明显的促进作用。厚壳贻贝多糖ＭＦ４可用于制备新的免疫增强制剂或抗肿瘤药物，本发明专利技术对开发利用中国的海洋生物资源开辟了新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药
，是从海洋动物厚壳贻贝中分离到一种新的具有增强免疫和抗肿瘤活性的多糖MF4。
技术介绍
厚壳贻贝(Mytilus Coruscus)属贻贝科(Mytilidae)贻贝属(Mytilus)；为温水性种，在我国主要分布在辽宁省的大连、小长山；山东省的青岛、砣矶岛、大钦岛、蓬莱、烟台、威海；浙江省的嵊泗列岛、舟山群岛、朱家尖、鱼山群岛、下大陈、南麂岛；福建省的平谭、厦门、东山。贝壳较大，厚重，呈楔形；成体体长100-200mm左右，壳长度为或大于高度的2倍，约为宽度的2.5-3倍。壳前端较尖细，后端宽圆；壳表较粗糙，被有棕褐色或栗褐色的壳皮(王祯瑞，中国动物志.软体动物门.双壳纲贻贝目.第1版.北京.北京科学出版社，1997)贻贝贝肉肉质含丰富的营养物质，是高级蛋白、维生素D的重要来源；文献报道(刘志峰等，中国海洋药物，2001，20(6)9)贻贝有抗动脉粥样硬化，降血脂，抑制血小板的凝聚从而抑制血栓的形成，改善心肌氧和营养物质的供应及保护实验性心肌缺血，改善微循环和降血压等功效，而对该种贻贝的活性成分未见报道。
技术实现思路
本专利技术从生长于中国浙江海域的厚壳贻贝中提取分离到一种新的具有免疫增强作用和抗肿瘤作用的多糖，命名为MF4，经理化性质分析，其理化性质为白色絮状化合物，易溶于水和二甲基亚砜，相对分子量为113,000，主要由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，比例依次为15∶15∶26∶37；糖苷键的构型为β构型；糖苷键的类型为1-4糖苷键，1-2糖苷键和五碳糖1-3糖苷键，比例依次为80∶9∶2；而存在于分支点处的糖苷键为1-6糖苷键和脱氧六碳糖1-2糖苷键，比例为7∶10；端基糖除了六碳糖外，分子还含有部分脱氧六碳糖。本专利技术厚壳贻贝多糖MF4的提取分离方法如下(1)提取将新鲜的厚壳贻贝贝肉洗净、用搅拌机搅碎后，在3倍体积沸水中加热提取4小时，提取液用2倍体积95％的乙醇沉淀，沉淀用乙醇、丙酮分别洗涤3次，用Savager法除蛋白2次(将沉淀与Savage试剂∶CHCl3-n-BuOH＝4∶1充分混匀，离心收集上清液，去除水与有机相之间的蛋白变性层)，收集水相，冷冻干燥，得厚壳贻贝多糖粗提物。(2)分离上述多糖粗提物用DEAE-纤维素-52(Pharmacia公司)分离，依次用0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mol/L的NaCl洗脱，收集0.5mol/L的洗脱部分，脱盐浓缩，冷冻干燥，得MF部分；MF用葡聚糖凝胶Sephadex G-100(Pharmacia公司)分离，以0.05mol/L的NaCl洗脱，收集第一个洗脱峰，脱盐浓缩，冷冻干燥；最后用HPLC处理，以0.1M磷酸盐缓冲系统(含有14.2g/L Na2SO4及0.5g/LNaN3的0.1mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液)作为流动相，收集第一个洗脱峰，脱盐浓缩，冷冻干燥，得到多糖MF4。本专利技术厚壳贻贝多糖MF4理化性质的分析方法及结果如下(1)HPGFC法纯度的鉴定分析柱为TSK-G3000SWXL，7.8mm×30cm(Merck公司)，流动相为含有14.2g/L Na2SO4及0.5g/L NaN3的0.1mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，进样量50μl，流速为0.8ml/min，示差检测。结果显示多糖MF4呈单一的对称峰，表明该样品的均一性。(2)HPGFC法相对分子量的测定条件同HPGFC法纯度的鉴定一样，以Dextran T10、T40、T70、T100、T120为标准分子量，测得各自的洗脱体积Ve，以葡萄糖T2000(Pharmacia公司)测得其外水体积Vo，葡萄糖测得柱的总体积Vt，以(Ve-Vo)/(Vt-Vo)对其分子量的对数作图得标准曲线，再以同样的条件及方法测得MF4洗脱体积，求出其相对分子量为113,000。(3)紫外光谱MF4经紫外扫描在250-280nm之间都无蛋白质及核酸特征吸收峰。(4)红外光谱MF4红外光谱显示出多糖的特征吸收峰，3442cm-1(OH伸缩振动)，1650cm-1(酰胺基C＝O伸缩振动)，1137cm-1，995cm-1(这一宽峰为糖苷键的吸收峰以及羟基的变角振动)。(5)1HNMR多糖质子信号大多堆集δ4.0-5.51的狭小范围内，除端基质子的信号在δ4.8-5.5较易解析外，其它H2-H6的信号均集中在δ4.0-4.8之间，解析困难。通常α-吡喃己糖端基质子的δ值往往超过5.0，而β型的δ值则小于5.0。 MF4的H-1质子信号不明显，δ应为小于5.0，和其他H2-H6的质子以及重水的信号相互重叠，故认为是β-吡喃己糖。(6)组分分析MF4用1mol/L的H2SO4水解8小时后制成糖腈乙酸酯衍生物用于GC-MS分析，与标准品对照显示其组成及比例为岩藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝15∶15∶26∶37。硫酸咔唑法糖醛酸的定性反应呈阴性。(7)糖苷键分析结果过碘酸氧化反应后加入酚酞指示剂呈现无色，说明无甲酸生成，从而判定其不含1-6糖苷键。Smith降解后进行糖腈乙酰化GC-MS分析，发现只有甘油和赤藓醇存在，没有单糖存在，说明含有1-4糖苷键和1-2糖苷键，而不含1-3糖苷键。多糖MF4甲基化后水解制成糖醇乙酰化衍生物GC-MS分析发现其含有1，5-二-O-乙酰基-6-脱O-2，3，4-三-O-甲基己糖醇，1，5-二-O-乙酰基-2，3，4，6-四-O-甲基己糖醇，1，3，5-三-O-乙酰基-2，4-二-O-甲基戊糖醇，1，2，4，5-四-O-乙酰基-6-脱O-3-O-甲基己糖醇，1，2，5-三-O-乙酰基-3，4，6-三-O-甲基己糖醇，1，4，5-三-O-乙酰基-2，3，6-三-O-甲基己糖醇，1，4，5，6-四-O-乙酰基-2，3-二-O-甲基己糖醇，1，4，5-三-O-乙酰基-2-乙酰胺基-3，6-二-O-甲基己糖醇，而且比例依次为8∶7∶1∶8∶7∶59∶6∶4，证实了过碘酸氧化和Smith降解分析结果，同时也说明该多糖糖苷键的类型为1-4糖苷键，1-2糖苷键和五碳糖1-3糖苷键，比例依次为80∶9∶2；而存在于分支点处的糖苷键为1-6糖苷键和脱氧六碳糖1-2糖苷键，比例为7∶10；端基糖除了六碳糖外，分子内所含的部分脱氧六碳糖也处在端基糖的位置。该多糖为首次从厚壳贻贝贝肉中提取分离到，命名为MF4。本专利技术对多糖MF4进行了体外和体内的免疫增强活性实验，表明可明显的促进NK细胞的活性和淋巴细胞的增殖，能提高免疫系统的功能。动物体内试验表明，对S180肉瘤和Lewis肺癌均有显著的抑制作用。故可用于制备免疫增强剂或抗肿瘤药物。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作详细的描述。实施例1.制备厚壳贻贝多糖MF4选择生长在浙江海域的厚壳贻贝新鲜贝肉16kg，洗净、用搅拌机搅碎后，在3倍体积量沸水中加热提取4小时，提取液用2倍体积95％的乙醇沉淀，沉淀用乙醇、丙酮分别洗涤3次，用Savager法除蛋白2次，冷冻干燥，得厚壳贻贝多糖粗提物。多糖粗提物用DEAE-纤维素-52分离，依次用0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mol/L的NaCl洗脱，收集0.5mol/L的洗脱部分，冷冻干燥，得MF部分。MF用葡聚本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种厚壳贻贝多糖ＭＦ４，其特征为白色絮状物，易溶于水和二甲基亚砜，相对分子量为１１３，０００，主要由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，比例依次为１５∶１５∶２６∶３７；糖苷键的构型为β构型；糖苷键的类型为１－４糖苷键，１－２糖苷键和五碳糖１－３糖苷键，比例依次为８０∶９∶２；而存在于分支点处的糖苷键为１－６糖苷键和脱氧六碳糖１－２糖苷键，比例为７∶１０；端基糖包含六碳糖和部分脱氧六碳糖。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：易杨华，马明华，李玲，刘宝姝，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。