一种环状转座子复合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种环状转座子复合物，所述环状转座子复合物包含Tn5转座酶和插入DNA；所述插入DNA包含转座子末端序列、2个标签序列和含酶切位点的DNA序列。本发明专利技术进一步公开了所述环状转座子在构建DNA文库中的应用。本发明专利技术利用环状转座子复合物构建DNA文库的方法操作简便，建库效率高，仅需80分钟即可完成文库构建全程，所需的DNA量也大幅下降，1～50ng的靶DNA即足以用于建库，推动二代测序技术在生命科研与精准医疗产业的广泛应用，具有重大而深远的意义。

Cyclic transposon complex and uses thereof

The invention discloses a transposon ring compound, the annular transposon complex contains the Tn5 transposase and insert DNA; DNA sequence DNA contains the insertion of transposon end sequences, 2 tag sequences and containing restriction sites. The present invention further discloses the application of the cyclic transposon in constructing a DNA library. The invention uses cyclic transposon complex construction of DNA library construction has the advantages of simple operation, high efficiency, complete library construction takes only 80 minutes to DNA, the required amount also fell sharply, from 1 to 50NG for target DNA is sufficient to promote the wide application of database, the two generation sequencing technology in life science research and medical precision industry, has great and far-reaching significance.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学与基因组学领域。更具体地，涉及一种环状转座子复合物及其应用。
技术介绍
DNA测序(DNAsequencing)作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，无法形成规模。随后在1977年Sanger专利技术了具有里程碑意义的双脱氧末端终止测序法(Sanger,F.；Nicklen,S.；Coulson,A.R.(1977),\DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors\,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA,74(12):5463–5467)，因其简单、快速，经过后续的不断改良，成为了相当一段时间内DNA测序的主流技术。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术(Next-generationsequencing)应运而生。与传统的Sanger测序方法相比，二代测序技术使得科学家们可以更加快速、廉价地对DNA与RNA进行测序，彻底变革了分子生物学与基因组学的研究(Quail,M.A.,I.Kozarewa,F.Smith,A.Scally,P.J.Stephens,R.Durbin,H.Swerdlow,andD.J.Turner.Alargegenomecenter’simprovementstotheIlluminasequencingsystem.Nat.Methods2008,5:1005-1010)。标准的传统二代测序文库构建包括如下步骤：(i)片段化，(ii)末端修复，(iii)5’末端磷酸化，(iv)3’末端加dA，从而可与测序接头连接，(v)连接接头，(vi)通过PCR富集两端均成功连接接头的产物(如图1)(StevenR.Head,H.KiyomiKomori,SarahA.LaMere,ThomasWhisenant,FilipVanNieuwerburgh,DanielR.Salomon,andPhillipOrdoukhanian,Libraryconstructionfornext-generationsequencing:Overviewsandchallenges.BioTechniques,2014,56:61–77)。该方法步骤较多，操作繁琐，耗时费力，因而有学者对其作出改进，将步骤(ii)～(v)整合在同一反应体系中(MNeiman,SSundling,HPHall,KCzene,etal.Librarypreparationandmultiplexcaptureformassiveparallelsequencingapplicationsmadeefficientandeasy.PlosOne2012,7(7):e48616-e48616)。但无论整合与否，建库过程中的3’末端加dA步骤，因为需要用Taq或exoKlenowDNA聚合酶为DNA3’端添加dA突出端，而此步骤的加3’末端dA效率较低，因此直接决定了产物两端均成功连接接头的效率较低，在很大程度上制约了建库效果。已有学者对以上建库方法作出改进(中国专利技术专利：201610537963.4；专利技术名称：一种高效的DNA接头连接方法)，使用具有不同末端结构的接头混合物与加A产物进行连接，接头混合物中的平末端、3’dT突出端、3’dG突出端，分别对应加A反应后，DNA分子末端可能具有的平末端、3’dA突出端、3’dG突出端三种结构，并分别与其连接。因此，无论DNA分子的加A效率如何，具有何种末端结构，均有与之相匹配的接头相连接，确保了分子两端添加接头效率的显著提升，有效改善了建库效率。但该方法仍然具有步骤较多、操作繁琐等缺点。ABhasin等发现Tn5Transposon可将任何双链DNA插入到其他DNA片段中(ABhasin，IYGoryshin，WSReznikoff.HairpinformationinTn5transposition.JournalofBiologicalChemistry,1999,274(52):37021-9)，唯一和必须的条件是此双链DNA的两端含19bp的特定顺序(MEDS)。Epicentre用此原理开发了将Tn5Transposon用于第一代测序的试剂盒(EZ-Tn5<KAN-2>InsertionKit)。在此之后Epicentre发现，Transposon可用于同时插入两条不同的DNA，只要这两条DNA链的一端有MEDS顺序，并在此基础上开发了第二代DNA测序试剂盒系列产品(TRANSPOSONENDCOMPOSITIONSANDMETHODSFORMODIFYINGNUCLEICACIDS.UnitedStatesPatentApplicationPub.No.US20110287435A1.)。该方法较之上文介绍的文库构建方案，步骤更加简单，易于操作，大幅缩短了建库操作时间。但该方法亦存在缺点：该方法理论上可在断裂形成的DNA片段两端加上不同标签，但实际操作过程中，转座子插入序列的方向是随机的，具有正反两种可能，因此DNA片段两端可能带有相同的标签，无法进行下游的PCR放大。实际上，可有效利用的DNA片段仅有50％。因此，需要开发简单、高效、易于操作、成本较低的转座子复合物及DNA文库构建技术，对于生命科研与精准医疗事业来说至关重要。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种环状转座子复合物，该转座子复合物可用于测序技术的基因组DNA文库构建、转录组测序文库构建。本专利技术的第二个目的在于提供一种包含上述环状转座子复合物的应用。本专利技术的第三个目的在于提供一种DNA文库的构建方法，通过“先插入、再切断”，一步完成“片段化——加标签”的全过程，提高建库效率，操作更简便。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种环状转座子复合物，所述环状转座子复合物包含Tn5转座酶和插入DNA。本专利技术所述插入DNA包含转座子末端序列、2个标签序列和含酶切位点的DNA序列；所述插入DNA两端为转座子末端序列，在转座子末端序列内侧则是2个标签序列；所述2个标签序列之间为含酶切位点的DNA序列；所述含酶切位点的DNA序列包括但不限于含U的单链或双链DNA序列、含限制性酶切位点的DNA序列、含有不互补碱基对的双链DNA序列。本专利技术优选的实施例中，所述环状转座子复合物有且仅有一个插入DNA。本专利技术所述的插入DNA可以通过化学合成或其它分子生物学方法获得，其结构形如“转座子末端序列——第一标签序列——酶解序列——第二标签序列——转座子末端序列”，其序列中第一标签序列和第二标签序列可以相同也可以不同，组成顺序固定，且每个转座子中保证有且仅有一个插入DNA分子，因此当两个标签序列不同时，这种结构的每个转座子所能提供的，是完全精确的两个不同的标签序列，确保了断裂片段两端的接头种类不同，使得靶DNA的利用率得到最大化。本专利技术进一步提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环状转座子复合物，其特征在于：所述环状转座子复合物包含Tn5转座酶和插入DNA。

【技术特征摘要】
1.一种环状转座子复合物，其特征在于：所述环状转座子复合物包含Tn5转座酶和插入DNA。2.根据权利要求1所述的环状转座子复合物，其特征在于：所述插入DNA包含转座子末端序列、2个标签序列和含酶切位点的DNA序列；所述插入DNA两端为转座子末端序列，在转座子末端序列内侧则是2个标签序列；所述2个标签序列之间为含酶切位点的DNA序列。3.根据权利要求2所述的环状转座子复合物，其特征在于：所述含酶切位点的DNA序列为含U的单链或双链DNA序列、含限制性酶切位点的DNA序列或含有不互补碱基对的双链DNA序列。4.根据权利要求1所述的环状转座子复合物，其特征在于：所述环状转座子有且仅有一个插入DNA。5.权利要求1-4任一所述环状转座子复合物在构建DNA文库中的应用。6.一种DNA文库的构建方法，其特征在于，该方法包括：获取靶DNA；制备环状转座子复合物：所述环状转座子复合物包含Tn5转座酶和插入DNA；将靶DNA与环状转座子复...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿亮，祝珍，辛文，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11