低分子量的肝素及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种亚硝酸裂解天然来源肝素得到的低分子量肝素，平均分子量在２１００Ｄａ到２７００Ｄａ之间，组分总数的９０％分子量在１５００Ｄａ到５４００Ｄａ之间。本发明专利技术的低分子量肝素抗Ⅱａ因子活性很低，抗Ⅹａ因子／抗Ⅱａ因子活性比超过２０，极大地减少了出血的可能性。本发明专利技术还公开了制备该低分子量肝素的方法，包括亚硝酸裂解、硼氢化钠还原、乙醇沉淀等步骤，具有很高的收率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肝素产品及其制备方法，尤其涉及一种。
技术介绍
血栓栓塞性疾病是当前人类所面对的严重威胁之一，具有相当高的发病率和死亡率，是严重危害人类健康的疾病，如冠心病心肌梗塞、深静脉血栓(DVT)形成、脑栓塞、肺栓塞(PE)等。此外，血栓形成是许多疾病发病机制中涉及的一种重要病理过程，如糖尿病小血管病变、肾小球肾炎、严重烧伤中局部病变的恶化、妊娠高血压综合征、视网膜静脉血栓形成、各种原因引起的弥漫性血管内凝血等。因此，预防和治疗血栓形成，对提高生存质量，降低疾病发生率以及死亡率都具有十分重要的意义。血栓栓塞性疾病的预防和治疗中，肝素具有重要的临床价值，作为传统的抗凝抗血栓药，已有60多年的应用历史，它疗效显著，很久以来，在临床上具有不可替代的重要地位，但同时它也存在着副作用较大的不足，尤其是容易引起粘膜出血，有时甚至会导致严重的颅内出血，据统计出血发生率可高达35％，因此临床应用时要进行严格的实验室监控。另外，肝素皮下注射生物利用度低，长期使用还会造成血小板减少、脂质代谢紊乱，从而限制了其药效的发挥及临床应用。八十年代中期，欧洲首先开发成功低分子肝素(LMWH)。低分子肝素是以普通肝素为原料，经物理分离或化学降解而得，平均分子量一般在4000-6500之间。欧洲药典(EP)规定至少有60％量的LMWH分子量应小于8000，并规定其抗FXa活性不得低于70IU/mg，抗FXa/FIIa活性不得低于1.5。LMWH已上市的药物有Enoxaparin，Fraxiparin，Dalteparin等，适应证包括血透时防止体外循环中发生凝血、深部静脉血栓(DVT)的预防和治疗以及不稳定型心绞痛、无Q波心肌梗塞。另外，在肾脏疾病、播散性血管内凝血(DIC)以及动脉粥样硬化、中风、缺血性脑病、重症肝炎、肺部疾病及其它血栓栓塞疾患等诸方面。肝素类产品主要通过与血液中抗凝血酶III(ATIII)结合，促进ATIII对凝血因子抑制来发挥抗凝、抗血栓作用。研究发现，对凝血因子Xa的抑制与抗栓作用相关，而灭活IIa因子(凝血酶)则增加出血危险性。肝素片段与ATIII结合需要一个特定的五糖序列，而抗IIa活性与肝素片段的长度有关，低于18糖的片段则没有抑制IIa活性，而抗Xa活性则不受影响。普通肝素平均分子量为12000-15000，抗Xa活性与抗IIa活性相同，而LMWH平均分子量为4000-6500，抗Xa/抗IIa一般为1.5-4，与普通肝素相比，具有较选择性的抗栓活性和低出血危险性，但仍含有相当比例的高分子量组分。因此，本领域迫切需要平均分子量更低，质量控制更严格，抗栓作用强、出血危险性小、半衰期长的低分子肝素产品。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种亚硝酸裂解天然来源肝素得到的低分子量肝素及其药用盐。本专利技术的另一目的是提供一种亚硝酸裂解天然来源肝素制备低分子量肝素的方法。本专利技术的亚硝酸裂解天然来源肝素得到的低分子量肝素，具有如下特性平均分子量小于8000Da，其组分中重量小于8000Da的部分不小于60％，抗Xa因子效价不低于50％，抗Xa/抗IIa活性比不小于1.5。在一个优选的方案中，本专利技术的低分子量肝素具有如下特性平均分子量在2100Da到2700Da之间；分子量分布组分总数的90％分子量在1500Da到5400Da之间；还原末端结构为2，5-脱水-甘露糖；硫酸化率不低于1.8；抗Xa因子活性不低于50IU/mg；抗Xa因子/抗IIa因子活性比不低于10。在进一步优选的方案中，本专利技术的低分子量肝素具有如下特征平均分子量在2100Da到2700Da之间；分子量分布组分总数的90％分子量在1500Da到5400Da之间，组分总数的50％分子量在2000Da到4000Da之间；还原末端结构为2，5-脱水-甘露糖；硫酸化率不低于1.8；抗Xa活性不低于60IU/mg；抗Xa因子/抗IIa因子活性比不低于20。本专利技术的制备低分子量肝素的方法，包括以下步骤解聚反应1-5％m/v的肝素溶液中，按每kg肝素加入40-70克亚硝酸钠的比例，在pH值为3-4，室温下处理2-4小时；还原反应按每kg肝素加入15-25g硼氢化钠的比例，在pH值为9～11，室温下对肝素还原15-20小时，过量硼氢化钠用盐酸破坏；分级分离用35-55％v/v乙醇沉淀，，沉淀物按30％m/v的比例溶于蒸馏水中，加入1％(m/m)氯化钠，加入5-12倍体积的乙醇，收集沉淀，冷冻干燥。在一个优选的方案中，本专利技术的亚硝酸裂解天然来源肝素制备低分子量肝素的方法，包括以下步骤解聚反应1-3％m/v的肝素溶液中，按每kg肝素加入50-60克亚硝酸钠的比例，在pH值为3-4，室温下处理2-4小时；还原反应按每kg肝素加入15-25g硼氢化钠的比例，在pH值为9～11，室温下对肝素还原15-20小时，过量硼氢化钠用盐酸破坏；分级分离40％v/v乙醇沉淀，进行沉淀，沉淀物按30％m/v的比例溶于蒸馏水中，加入1％(m/m)氯化钠，加入8～15倍体积的乙醇，收集沉淀，冷冻干燥。与现有的低分子量肝素相比，本专利技术的低分子量肝素具有如下优点抗IIa因子活性很低，极大地减少了出血的可能性。肝素分子分子量低于1500Da将失去溶栓活性，高于5400Da将有出血的副作用。本专利技术的低分子量肝素组分总数的90％分子量在1500Da到5400Da之间，为选择性溶栓的有效分子，因此溶血副作用极低。治疗指数提高。本专利技术的低分子量肝素在降低抗IIa因子活性的同时，基本保持了抗Xa因子活性。抗Xa因子/抗IIa因子活性比远远超过现有的低分子肝素的1.5，在一个优选的方案中，抗Xa因子/抗IIa因子活性比超过20。分子量分布更加集中。在一个优选的方案中，组分总数的90％分子量在1500Da到5400Da之间，组分总数的50％分子量在2000Da到4000Da之间，使得质量控制严格，产品质量更加稳定。本专利技术的方法有很高的收率。在一个优选的方案中，收率达到55％。附图说明图1为HPLC凝胶色谱图谱。图2为抗Xa因子效价测定标准曲线。图3为抗Xa因子效价测定标准曲线。具体实施例方式肝素的亚硝酸裂解在低pH值(2.5-4.0)的条件下，亚硝酸首先作用于肝素分子的N-硫酸葡糖胺单位，脱去HSO4-形成-NH2。-NH2与HNO2发生重氮化反应，在放氮同时糖苷键断裂，电子转移，缩环生成2，5-脱氢甘露糖或脱氢甘露糖醇。亚硝酸与N-硫酸葡萄糖胺反应机理如下 亚硝酸控制解聚生产低分子肝素的过程受温度、溶液pH值、亚硝酸的浓度及解聚时间的影响较大。一般来说，反应温度控制在-5℃-30℃，低于-5℃溶液就要凝固，高于30℃，LMWH可能被破坏。溶液pH值为1.5时，反应需5-10min，而当pH值为4时，反应则长达10-18h，亚硝酸的具体用量要根据设计的分子量决定。低浓度的亚硝酸不能很好的解聚肝素，高浓度时又会导致肝素在不适宜的位置断裂，使结构发生变化。另外，通过控制亚硝酸和肝素的比例，可使反应自我调节终止。分子量测定及计算平均分子量按照高效液相色谱法测定(中国药典 2000年版 二部附录VD)。紫外检测器和示差检测器按顺序串连使用，紫外检测器的检测波长为234nm，示差检测器接紫外检测器输出端。低分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亚硝酸裂解天然来源肝素得到的低分子量肝素，其特征在于，具有如下特性：平均分子量小于８０００Ｄａ，其组分中重量小于８０００Ｄａ的部分不小于６０％，抗Ⅹａ因子效价不低于５０％，抗Ⅹａ／抗Ⅱａ活性比不小于１．５ 。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王作鹏，张立红，
申请(专利权)人：上海复旦张江生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]