一种高保真DNA聚合酶干粉试剂盒的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种高保真DNA聚合酶干粉试剂盒的制备方法，包括如下步骤：构建重组表达载体，制备重组表达菌株并培养，使能够表达高保真DNA聚合酶的DNA分子在重组表达菌株中表达；提取高保真DNA聚合酶；提纯高保真DNA聚合酶；冻干高保真聚合酶。本发明专利技术使用的宿主细胞为BL21，该菌株用于高效表达克隆与含有T7启动子的表达载体的基因。两者结合有利于大量高效表达高保真DNA聚合酶，使产量得到大幅度的提升。

Method for preparing high fidelity DNA polymerase dry powder reagent kit

The invention relates to a preparation method of a high fidelity DNA polymerase powder kit, which comprises the following steps: to construct the recombinant expression vector, preparation of recombinant expression strains and culture, which can express DNA molecule high fidelity DNA polymerase expression strains expressed in recombinant high fidelity DNA polymerase; extraction; purification of high fidelity DNA polymerase; lyophilized polymerase. The host cell used in the invention is BL21, which is used for efficiently expressing clones and genes expressing an expression vector containing a T7 promoter. The combination of these two methods is conducive to a large number of efficient expression of high fidelity DNA polymerase, which greatly improves production.

【技术实现步骤摘要】
一种高保真DNA聚合酶干粉试剂盒的制备方法
本专利技术涉及用作基因工程的试剂，具有高保真性的DNA聚合酶，尤其涉及一种高保真DNA聚合酶干粉试剂盒及其制备方法。
技术介绍
DNA聚合酶(DNApolymerase)，是细胞DNA复制的重要酶，主要应用在聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)中。DNA聚合酶主要分为六个类型：A、B、C、D、X、Y，通常所用的属于B型聚合酶。高保真DNA聚合酶是从Pyrococcusfuriosis中提取的耐高温DNA聚合酶，是保真性最好的聚合酶之一。最初使用的高保真DNA聚合酶直接从菌体中分离纯化，但难以得到大量的酶，后来的研究者将其基因重组到其它宿主细胞中得以表达，再经提取纯化即可满足应用要求。PfuDNA聚合酶(PfuDNApolymerase)，又称Pfu聚合酶，或Pfu酶，是在嗜热的古核生物火球菌属内发现的，一类能在活体内进行DNA复制的酶。该酶含有2个蛋白亚基(P45和P50),为多聚体,分子量约为90kDa。该酶同时具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切核酸酶活性,因此在聚合反应中可纠正错误掺入的碱基,忠实性极高。体外实验中，在聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)中，使用Pfu聚合酶可以快速，高保真的扩增DNA片段。但高保真DNA聚合酶作为一种酶制剂，对温度较为敏感，常温下活性降低较快，所以在运输过程中采取干冰或蓝冰冷藏运输，而干冰作为一次性使用介质，并且价格较为昂贵，使企业的运输成本增大。
技术实现思路
针对以上现有技术问题，本专利技术的目的在于提供一种高保真DNA聚合酶干粉的制备方法，通过将酶制剂冻干成粉末，使高保真DNA聚合酶的运输常温即可进行，以解决现有技术中导致的上述缺陷。具体技术方案如下：一种高保真DNA聚合酶干粉试剂盒的制备方法，包括如下步骤：(1)构建重组表达载体，制备重组表达菌株并培养，使能够表达高保真DNA聚合酶的DNA分子在重组表达菌株中表达；(2)提取高保真DNA聚合酶；(3)提纯高保真DNA聚合酶；(4)冻干高保真聚合酶。进一步地，步骤(1)中，将能够表达高保真DNA聚合酶的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体。进一步地，步骤(1)中，将重组表达载体转入宿主细胞，获得重组表达菌株。进一步地，步骤(1)中，加入诱导剂使能够表达高保真DNA聚合酶的DNA分子在重组表达菌株中表达。进一步地，步骤(2)中包括：(2-1)收集诱导表达后的细胞液；(2-2)离心收集菌体；(2-3)用BufferA重悬菌体；(2-4)加入溶菌酶进行破壁处理；(2-5)离心收集上清液。进一步地，步骤(3)中包括：(3-1)取上清液冷却至0℃；(3-2)在磁力搅拌器上缓慢搅拌2个小时；(3-3)同时缓慢加入固体硫酸铵至饱和度为40％～60％；(3-4)离心收集沉淀；(3-5)将沉淀加BufferB溶解后以超纯水为透析液进行透析；(3-6)置于磁力搅拌器缓慢搅拌；(3-7)更换透析液两次并过夜。进一步地，步骤(4)中将透析过后的粘稠状高保真DNA聚合酶溶液真空冷冻干燥，获得高保真DNA聚合酶干粉。进一步地，所述表达载体为pET-24a，pET-17b或pSE380。进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌，优选JM-109、BL21。进一步地，所述的BufferA为50mMTris-盐酸缓冲液、2mMEDTA、2mM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟；所述的BufferB为50mMTris-盐酸缓冲液、1mMEDTA、10％甘油、1mM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟；所述的真空冻干高保真DNA聚合酶的条件为：预冻温度-40℃～-60℃，时间4-12h；回热温度-30～-40，时间3～8小时；真空度1.0～20mbar；真空干燥时间24～48h；最终干燥温度20～30℃。与目前现有技术相比，本专利技术使用的宿主细胞为BL21，该菌株用于高效表达克隆与含有T7启动子的表达载体(如pET-24a)的基因。两者结合有利于大量高效表达高保真DNA聚合酶，使产量得到大幅度的提升。其次，本专利技术将高保真DNA聚合酶采取冷冻干燥的方法处理，不仅减少了企业的运输成本，而且粉末状的DNA聚合酶的保质期比液态的更长。附图说明图1为为高保真DNA聚合酶干粉的冷冻曲线示意图具体实施方式下面根据附图对本专利技术进行详细描述，其为本专利技术多种实施方式中的一种优选实施例。在一个优选实施例中，一种高保真DNA聚合酶干粉的制备方法，包含如下步骤：1)将能够表达高保真DNA聚合酶的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；将重组表达载体转入宿主细胞，获得重组表达菌株；对重组表达菌株进行培养，加入诱导剂使能够表达高保真DNA聚合酶的DNA分子在重组表达菌株中表达。2)提取高保真DNA聚合酶：收集诱导表达后的细胞液，离心收集菌体，用BufferA重悬菌体，加入溶菌酶进行破壁处理。离心收集上清液。3)提纯高保真DNA聚合酶：取上清液冷却至0℃，然后在磁力搅拌器上缓慢搅拌2个小时，与此同时缓慢加入固体硫酸铵至饱和度为40％～60％，离心收集沉淀，将沉淀加BufferB溶解后以超纯水为透析液进行透析，置于磁力搅拌器缓慢搅拌，更换透析液两次并过夜。4)冻干高保真聚合酶：将透析过后的粘稠状高保真DNA聚合酶溶液真空冷冻干燥，获得高保真DNA聚合酶干粉。在另一个优选实施例中，可以采用如下方案：高保真DNA聚合酶干粉试剂盒及其制备方法，包含如下步骤：1)将能够表达高保真DNA聚合酶的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；将重组表达载体转入宿主细胞，获得重组表达菌株；对重组表达菌株进行培养，加入诱导剂使能够表达高保真DNA聚合酶的DNA分子在重组表达菌株中表达。2)提取高保真DNA聚合酶：收集诱导表达后的细胞液，离心收集菌体，用BufferA重悬菌体，加入溶菌酶进行破壁处理。离心收集上清液。3)提纯高保真DNA聚合酶：取上清液冷却至0℃，然后在磁力搅拌器上缓慢搅拌2个小时，与此同时缓慢加入固体硫酸铵至饱和度为40％～60％，离心收集沉淀，将沉淀加BufferB溶解后以超纯水为透析液进行透析，置于磁力搅拌器缓慢搅拌，更换透析液两次并过夜。4)冻干高保真聚合酶：将透析过后的粘稠状高保真DNA聚合酶溶液真空冷冻干燥，获得高保真DNA聚合酶干粉。所述表达载体为pET-24a、pET-17b、pSE380，优选pET-24a，所述宿主细胞为大肠杆菌，更具体为JM-109、BL21，优选BL21，所述的BufferA为50mMTris-盐酸缓冲液(pH7.5～8.5)、2mMEDTA、2mM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟。所述的BufferB为50mMTris-盐酸缓冲液(pH6.5～8.0)、1mMEDTA、10％甘油、1mM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟。所述的真空冻干高保真DNA聚合酶的条件为：预冻温度-40℃～-60℃，时间4-12h；回热温度-30～-40，时间3～8小时；真空度1.0～20mbar；真空干燥时间24～48h；最终干燥温度20～30℃。优选实施案例1将能够表达高保真聚合酶的DNA分子加载到表达载体pET-17b上，构建表达载体。将表达载体转化到宿主细胞大肠杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高保真DNA聚合酶干粉试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建重组表达载体，制备重组表达菌株并培养，使能够表达高保真DNA聚合酶的DNA分子在重组表达菌株中表达；(2)提取高保真DNA聚合酶；(3)提纯高保真DNA聚合酶；(4)冻干高保真聚合酶。

【技术特征摘要】
1.一种高保真DNA聚合酶干粉试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建重组表达载体，制备重组表达菌株并培养，使能够表达高保真DNA聚合酶的DNA分子在重组表达菌株中表达；(2)提取高保真DNA聚合酶；(3)提纯高保真DNA聚合酶；(4)冻干高保真聚合酶。2.如权利要求1所述的高保真DNA聚合酶干粉试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将能够表达高保真DNA聚合酶的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体。3.如权利要求2所述的高保真DNA聚合酶干粉试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将重组表达载体转入宿主细胞，获得重组表达菌株。4.如权利要求1或2所述的高保真DNA聚合酶干粉试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，加入诱导剂使能够表达高保真DNA聚合酶的DNA分子在重组表达菌株中表达。5.如权利要求1-4所述的高保真DNA聚合酶干粉试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中包括：(2-1)收集诱导表达后的细胞液；(2-2)离心收集菌体；(2-3)用BufferA重悬菌体；(2-4)加入溶菌酶进行破壁处理；(2-5)离心收集上清液。6.如权利要求1-5所述的高保真DNA聚合酶干粉试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中包括：(3-1)取上清液冷却至0℃；(3-2)在磁力搅拌器上缓慢搅拌2个小时；(3-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：周辉，
申请(专利权)人：周辉，
类型：发明
国别省市：安徽,34