本发明专利技术公开了一种人lncRNA及其病毒载体在制备抑制真皮成纤维细胞胶原合成药物中的应用，该lncRNA过表达的病毒载体感染的人真皮成纤维细胞中胶原基因COL1A1、COL1A2以及COL3A1的蛋白表达量显著降低，显著抑制了胶原合成量。该lncRNA及其过表达的病毒载体可用于制备抑制真皮成纤维细胞合成胶原的药物，为抑制疤痕增生提供了新的靶点。
Application of human lncRNA and its viral vector in preparing medicine for inhibiting dermal fibroblast collagen synthesis
The invention discloses a lncRNA virus vector in the preparation and application of collagen fibers inhibit dermal cells synthesize drugs, the lncRNA virus expression vector of human dermal fibroblast collagen genes COL1A1, COL1A2 and COL3A1 protein expression was significantly reduced, significantly inhibited the synthesis of collagen content. The lncRNA and its over expressed viral vector can be used for the preparation of drugs to inhibit the synthesis of collagen from dermal fibroblasts and provide a new target for inhibiting scar hyperplasia.
【技术实现步骤摘要】
一种人lncRNA及其病毒载体在制备抑制真皮成纤维细胞胶原合成药物中的应用
本专利技术涉及基因工程、细胞学领域，具体地说涉及一种人lncRNA及其病毒载体在制备抑制真皮成纤维细胞胶原合成药物中的应用。
技术介绍
增生性疤痕是指皮肤真皮层受损后的愈合期间，胶原局部过量沉积形成突出于皮肤表面的增殖性疤痕组织。皮肤损伤及外科手术后，疤痕的总体发病率为40％～70％，烧伤患者的发病率高达91％。增生性疤痕是烧伤外科和整形外科界面临的巨大挑战，因其不仅影响美观，特殊部位的疤痕还会影响患者的生活质量，给他们带来生理和心理的双重压力。目前，虽然有手术切除、压力治疗、局部皮质激素注射等方法治疗疤痕，但是均存在局限性或不良并发症，无法从根本上阻止疤痕产生。目前已知增生性疤痕形成的病理学本质是真皮层中细胞外基质的过量沉积，其主要成分是由真皮成纤维细胞合成的胶原，尤以I、III型胶原为主。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种特异高表达于真皮成纤维细胞胶原合成的分离lncRNA及其的引物对，以及含有前述过表达lncRNA的病毒载体及宿主细胞；本专利技术还有一个目的是提供前述lncRNA、病毒载体、宿主细胞在制备抑制真皮成纤维细胞胶原合成药物中的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术的一种分离的lncRNA，含有如SEQIDNO.1所示的基因序列。所述lncRNA的转录本核苷酸序列位于人的第7号染色体上COL1A2基因5’端上游位置，与COL1A2为天然反义(NaturalAntisense)的关系。增生性疤痕形成的病理学本质是真皮层中细胞外基质的过量沉积，其主要成分是由真皮成纤维细胞合成的胶原(collagen)，尤以I、III型胶原为主。本专利技术是基于增生性疤痕的形成机制，采用lncRNA芯片(lncRNAArray)技术筛选获得特异高表达于真皮成纤维细胞胶原合成的人lncRNA。目前没有关于该lncRNA相关的报道。所述SEQIDNO.1的序列为：CCUGGACCUAGAAACAAAAAAUGAAAGUGGAGAAAACCAAACAAGAAUCUUUCUUUCUUAAAGUAAACAUCGGACUGACAUCUCCUUUCAAACAUUCAUUGAGGAUCUACUCUGUGAGAAGAAGCAAUACCAUGUUAUCUCAUUCUAGUUCCAGUUCUAGUUGACUUGAUUGUCAAACGACUGCUAAGAAGGUGAAAUAGAGGAGAUGACAUGAAUGAGGGACUACAUUGGAAUGAAGAAGAACCUGGAGGAGGUAAAAAAACUGAAGGCUCCGGAUGUCGGACGAUGGAAAAUAAAAACAACAAGCAAGUGAAACUCCCUGACUUAUCAACCUUACUCAAGAAUUCCUUCU本专利技术通过构建慢病毒过表达质粒载体，经包装、感染，来干扰人真皮成纤维细胞的胶原合成，从而抑制疤痕增生。所述的病毒载体含有前述lncRNA序列。具体地说，先提取人离体增生性疤痕组织的lncRNA，合成cDNA第一链，然后设计引物PCR扩增所述lncRNA，在反应体系中与双酶切扩增序列和载体，建立连接反应；然后转化、筛选阳性克隆、抽提质粒并测序验证。接着转染慢病毒表达质粒、包装质粒，获取病毒上清液后，过滤冻存。其中，扩增所述lncRNA的引物对分别如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，经设计分别含有BamHI和EcoRI酶切位点：上游引物：5′-GCCGGATCCCCTGGACCTAGAAACAAAAAATG-3’；下游引物：5′-ACCGAATTCAGAAGGAATTCTTGAGTAAGG-3’，上述划线区域即分别指示了BamHI位点和EcoRI位点。经PCR获得的产物切胶进一步纯化回收，选用Gel/PCRExtractionKit，购于Biomiga公司。所述转化步骤之后，37℃孵育培养并挑取阳性克隆，选用德国QIAGEN公司的PlasmidMiniKit质粒抽提试剂盒抽提质粒。所述慢病毒包装是在37℃、5％CO2孵箱中，以含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基(购于美国Sciencell公司)培养病毒包装细胞HEK-293T细胞(该细胞保藏于美国ATCC，编号ATCCACS-4500，购于北纳创联生物技术研究院，并接种于6孔板中，待细胞融合度达80％左右时，共转染慢病毒表达质粒与包装质粒；转染试剂、表达/包装质粒按体积比为2.5∶1，慢病毒表达质粒与包装质粒按质量比为Pcgvp、Rev、Vsvg比例为1.5∶1.5∶1∶0.5。转染收取病毒上清液于0.45μM滤器过滤后，分装-80℃冻存。其中，所述转染试剂为购于美国Invitrogen公司的LipofectamineTM2000。设计试验，利用上述慢病毒感染离体人真皮成纤维细胞(即宿主细胞)，感染效率在80％以上时抽提RNA，RT-PCR鉴定所述lncRNA在人真皮成纤维细胞中的过表达。并利用WesternBlot法检测过表达真皮成纤维细胞的蛋白表达量。WesternBlot实验表明，本专利技术所述人lncRNA过表达组的真皮成纤维细胞中胶原基因COL1A1、COL1A2以及COL3A1的蛋白表达量显著降低，表明真皮成纤维细胞中过表达lncRNA可显著抑制胶原合成量。因此，所述lncRNA及其过表达的病毒载体可用于制备抑制真皮成纤维细胞合成胶原的药物，为抑制疤痕增生提供了新的靶点。附图说明图1为本专利技术pGLV-H1-GFP/Puro载体图谱和lncRNA的插入位点；图2为本专利技术lncRNA过表达慢病毒载体酶切的电泳图谱；图3为本专利技术lncRNA的测序鉴定结果；图4为本专利技术试验例1中人lncRNA过表达慢病毒感染人真皮成纤维细胞的RT-PCR鉴定；图5为本专利技术试验例2中Westernblot检测胶原基因COL1A1、COL1A2以及COL3A1的蛋白表达量以及灰度分析结果；其中，空白：不做任何处理的真皮成纤维细胞，对照：pGLV-H1-GFP/Puro空载转染对照细胞，lncRNA：pGLV-H1-lncRNA-GFP/Puro过表达的真皮成纤维细胞。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明。如本文所用，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本专利技术所需表达的载体，以及利用现有的质粒产品和试剂盒包装本专利技术所述的病毒载体。这些方法包括体外重组DNA技术、基因合成技术、病毒重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。实施例一、试验材料pGLV-H1-GFP/Puro质粒购自上海吉玛公司，包装质粒Pcgvp、Rev、Vsvg购自美国AlleleBiotech&Pharmaceuticals公司；RNA逆转录试剂盒和RNA检测试剂盒等购自美国ThermoFisher公司，PCR试剂盒Ta本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种引物对，其特征在于：所述引物对序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种引物对，其特征在于：所述引物对序列分别如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：含有BamHI和EcoRI酶切位点。3.一种分离的lncRNA，其特征在于：是通过如权利要求1所述引物对扩增获得的SEQIDNO.1的序列。4.一种lncRNA过表达的病毒载体，其特征在于：含有权利要求3所述的基因序列。5.根据权利要求4所述的一种lnc...
【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，李景云，
申请(专利权)人：南京市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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