The invention relates to a method for separating and culturing human retinal pigment epithelial cells, which belongs to the technical field of biomedicine. The RPE cells were separated and cultured by soaking, washing, separating, soaking, washing, cleaning, digesting and culturing. The invention uses the biological and mechanical method to separate the human retinal pigment epithelial cells derived from the fetus, namely RPE cells, and culture in vitro. The invention provides for methods of isolation and culture of human RPE cell layer is simple; to preserve integrity of RPE cell layer of the maximum in the course of cell separation; cell separation in the process to complete the RPE cell layer and choroid layer separated cells obtained high purity cell culture; subsequent purity high, high homogeneity, the proliferation ability of excellent, have differentiated into cells with typical morphology; for in vitro expansion of RPE cells, RPE cells, AMD treatment provides a new source of damage.
【技术实现步骤摘要】
一种人类视网膜色素上皮细胞层的分离培养方法
本专利技术涉及一种人类视网膜色素上皮细胞层的分离培养方法,具体涉及人类RPE细胞的分离培养,属于生物医学
技术介绍
RPE细胞层是位于视网膜外部的连续单层细胞,因其铺路石状的形态和胞质内丰富的黑色素而得名。它们在视网膜细胞的维持和自我更新上发挥重要的功能,如:吞噬消化脱落的光感受器细胞的OS;促进视循环中重要的介质11-顺视黄醛的再生;调节眼内的免疫反应;参与形成视网膜-血管屏障等。RPE细胞的这一生理功能异常被认为与相关眼科疾病的发生密切相关,如RPE细胞屏障功能异常则易导致Best卵黄样黄斑营养不良(Bestvitelliformmaculardystrophy,BVMD)和成人卵黄样黄斑营养不良(adult-onsetitelliformmaculardystrophy,AVMD)。RPE基底膜与Bruch’smembrane之间的连接或功能异常被认为与年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)和Sorsby’s眼底营养不良的发生相关。AMD主要表现为RPE细胞层对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降,结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中,并向细胞外排除沉积于Bruch膜,形成玻璃膜疣。AMD分为干性和湿性两种,其中,干性AMD更为常见,是由于RPE细胞进行性营养不良造成的脉络膜毛细血管和光受体缺失的一种疾病。湿性AMD的典型特征是由脉络膜新生血管(choroidalneovascularization,CNV)生成,从而造成严重的视力丧 ...
【技术保护点】
一种人类视网膜色素上皮细胞的分离培养方法,其特征是步骤为:(1)缓冲液浸泡清洗:将待处理的眼球放入加有青霉素‑链霉素的DPBS缓冲液浸泡中浸泡4~6min;将浸泡完毕的眼球用DPBS缓冲液清洗1~3次,每次8~12s;(2)分离:对步骤(1)所得眼球分离角膜和虹膜,去除晶状体和玻璃体,轻轻挤压,使眼杯展开,去除神经层;(3)酶溶液浸泡清洗:将步骤(2)所得视杯转移到1~3mL 1X的分离酶溶液中,在37℃下消化20~30min;(4)清洗:将步骤(3)所得视杯转移到DPBS缓冲液中,从视杯中揭下RPE细胞层,并将RPE细胞层转移到5~10mL的DPBS缓冲液中,1800‑2200rpm离心5~10min;(5)消化:离心结束后吸除上清,加入1~2mL 质量浓度为0.25%的TE缓冲液,在37℃下消化5~10 min;(6)培养重悬:在步骤(5)所得消化后的RPE细胞层中加入4~8mL RPE培养基,1800~2200rpm离心5~10min,吸除上清再用2~4mL RPE培养基重悬,然后接种到cell‑start基质胶包被的六孔板的一孔中;培养至第三天换液,然后每隔两天换液一次,直到细 ...
【技术特征摘要】
1.一种人类视网膜色素上皮细胞的分离培养方法,其特征是步骤为:(1)缓冲液浸泡清洗:将待处理的眼球放入加有青霉素-链霉素的DPBS缓冲液浸泡中浸泡4~6min;将浸泡完毕的眼球用DPBS缓冲液清洗1~3次,每次8~12s;(2)分离:对步骤(1)所得眼球分离角膜和虹膜,去除晶状体和玻璃体,轻轻挤压,使眼杯展开,去除神经层;(3)酶溶液浸泡清洗:将步骤(2)所得视杯转移到1~3mL1X的分离酶溶液中,在37℃下消化20~30min;(4)清洗:将步骤(3)所得视杯转移到DPBS缓冲液中,从视杯中揭下RPE细胞层,并将RPE细胞层转移到5~10mL的DPBS缓冲液中,1800-2200rpm离心5~10min;(5)消化:离心结束后吸除上清,加入1~2mL质量浓度为0.25%的TE缓冲液,在37℃下消化5~10min;(6)培养重悬:在步骤(5)所得消化后的RPE细胞层中加入4~8mLRPE培养基,1800~2200rpm离心5~10min,吸除上清再用2~4mLRPE培养基重悬,然后接种到cell-start基质胶包被的六孔板的一孔中;培养至第三天换液,然后每隔两天换液一次,直到细胞达到覆盖90%时传代。2.如权利要求1所述人类视网膜色素上皮细胞层的分离培养方法,其特征是:步骤(1)所述加有青霉素-链霉素的DPBS缓冲液配置过程如下:取500mL的DPBS缓冲液,添加10mL的青霉素-链霉素,充分混合。3.如权利要求1所述人...
【专利技术属性】
技术研发人员:李宁,谢磊,范国平,吕志刚,方攀峰,
申请(专利权)人:江苏艾尔康生物医药科技有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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