一种线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学技术领域。该探针分子结构式如式I所示：

Mitochondrial targeted hydrogen peroxide molecular fluorescent probe, preparation method and application thereof

The invention discloses a mitochondrial targeting hydrogen peroxide molecular fluorescent probe, a preparation method and an application thereof, belonging to the technical field of analytical chemistry. The molecular structure of the probe is shown in the formula I:

【技术实现步骤摘要】
一种线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学

技术介绍
活性氧(ROS)是生物体内在很多生理和病理过程起着非常重要作用的一些含氧原子的物质总称，包括自由基(羟基自由基和超氧阴离子自由基等)和非自由基(过氧化氢和次氯酸等)。各种活性氧(ROS)中，过氧化氢是生命系统中最重要的一种，是大部分氧化酶过程中的产物并参与很多生物体内调节过程。在正常生理浓度下，H2O2对生物正常的生理过程是有益的，它们参与细胞内蛋白质的可逆氧化，调节蛋白质的磷酸化到基因表达等细胞过程。过氧化氢在细胞生长和增殖方面起着十分重要的作用。但是，体内异常的H2O2会导致许多疾病的产生，例如炎症性疾病，癌症，糖尿病，心血管疾病和神经系统性疾病。因此，适时准确地检测体内过氧化氢的含量对于相关疾病的预防、诊断以及病理的研究具有十分重要的指导意义。然而，目前对H2O2的检测缺少靶向性，不能对细胞内某一特定的细胞器内的过氧化氢进行检测，特别缺少对细胞内线粒体靶向的过氧化氢探针，从而缺少研究细胞病变过程中对线粒体中过氧化氢浓度变化情况的检测工具。
技术实现思路
针对目前过氧化氢分子荧光探针检测所面临的问题，本专利技术通过分子设计，合成出一种具有响应时间快以及线粒体靶向性的过氧化氢荧光探针。本专利技术还提供了上述过氧化氢分子荧光探针的制备方法和应用。本专利技术采用以下技术方案：一种线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针，其结构式如式I所示：简记为Mito-H2O2。上述的线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针的制备方法，它包括以下步骤：(1)将1eq的4-溴二乙胺基苯胺、0.1eq的醋酸钯和0.3eq的三(邻甲基苯基)磷溶于由Et3N和DMF按照体积比5:3组成的溶液中，在氮气保护的条件下将4eq的4-乙烯基吡啶注入上述溶液中，加热反应；用TCL板检测反应，反应完全后，分离提纯可得到化合物1，化合物1结构式如下所示：(2)将1eq的化合物1和1eq的对苄基溴频哪醇硼酸酯溶于乙腈中，氮气保护，加热回流反应，用TCL板检测反应，反应完全后，分离提纯可以得到目标化合物Mito-H2O2。上述的过氧化氢荧光探针的合成路线如下：所述步骤(1)中加热反应温度为120℃，反应时间为14小时。所述步骤(1)中分离提纯的具体方法为：将反应产物先用二氯甲烷萃取2-3次，饱和食盐水洗涤2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，最后用柱色谱层析进行分离；所述柱色谱分离的洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:10。所述步骤(2)中加热反应的温度为85℃，反应时间为7小时。所述步骤(2)中分离提纯的具体方法为：将反应产物减压旋干溶剂得粗产品，然后柱色谱层析分离；所述柱色谱层析分离的洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:20。本专利技术还提供了一种上述的过氧化氢分子荧光探针的应用，所述荧光探针可以应用于水环境和生物细胞体系中过氧化氢的含量传感检测；所述的传感检测包含荧光检测、细胞成像检测。本专利技术的优点是：(1)探针的合成只需要两步就可以完成，且后处理过程相对简单；(2)本专利技术实现了H2O2分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。(3)此探针可以应用于检测细胞内线粒体中的过氧化氢的检测，通过与商业化线粒体染料进行比较，其对线粒体内过氧化氢成像的重合率高，两种染料的共定位系数为0.90，说明此探针可以作为细胞内线粒体内过氧化氢检测探针。基于此探针的特异性且显著的颜色变化，该试剂也可作为显示水溶液中过氧化氢分子存在的专一性指示剂，可进行对过氧化氢实时定性及定量的荧光检测。故而，本专利技术是一种简单，快速，灵敏的过氧化氢分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。其性能将在实施例中结合附图给予详细说明。附图说明图1是实施例一中探针Mito-H2O2的1HNMR图谱；图2是探针Mito-H2O2随过氧化氢的加入荧光谱图的变化情况；图3是探针Mito-H2O2对不同离子和分子的选择性荧光谱图；图4是探针Mito-H2O2对不同离子和分子的选择性柱状图数据，其中1.Blank；2.Br-；3.Cys；4.F-；5.Fe2+；6.Fe3+；7.GSH；8.HClO；9.Hg2+；10.NO；11.NO2-；12.NO3-；13.S2-；14.过氧叔丁醇；15.过氧叔丁谜；16.H2O2；图5是探针Mito-H2O2溶液在过氧化氢加入前后溶液用紫外灯照射后荧光颜色的变化；图6是探针Mito-H2O2过氧化氢荧光探针检测外源性过氧化氢荧光成像图；其中a)参比样细胞明场成像图，b)参比样绿通道荧光成像图，c)参比样明场与荧光成像图重合图片，d)探针浓度为10μM加入到HeLa细胞中培养30min后明场图，e)过氧化氢50μM加入后30min后的绿通道荧光成像图，f)明场与荧光成像图重合图片；图7是Mito-H2O2过氧化氢荧光探针检测外源性过氧化氢荧光成像图与商业化染料线粒体红的共定位成像图。a)探针浓度为10μM与线粒体红10nM加入到HeLa细胞中培养30min后明场图，b)加入过氧化氢并培养30min后绿通道荧光成像图，c)商业染料线粒体红荧光成像图，d)明场、绿通道与红通道叠加图，e)绿通道与红通道叠加图，f)绿通道与红通道叠加箭头部分荧光强度比较，g)绿通道与红通道叠加部分强度散点图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对于上述方案中化合物的号码。实施例1化合物1的合成：将4-溴二乙胺基苯胺(1.0g，2.4mmol，1eq)，醋酸钯(50mg，0.2mmol，0.1eq)，三(邻甲基苯基)磷(150mg，0.5mmol，0.3eq)，溶于(体积比Et3N：DMF＝5:3)30mL溶液中，氮气保护，然后将4-乙烯基吡啶(1.0g，9.6mmol，4eq)用注射器打入上述溶液中。120℃加热，反应14小时。用TCL板检测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取2-3次，饱和食盐水洗涤2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离得到化合物1，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷＝1:10。化合物1的产率为75％。化合物Mito-H2O2的合成：将化合物1(100mg，0.396mmol，1eq)，对苄基溴频哪醇酯(117.6mg，0.396mmol，1eq)，溶于3mL乙腈中，氮气保护，85℃加热回流反应7小时，用TCL板检测反应，反应完全后，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离得到目标终产物，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷＝1:20。得产物Mito-H2O2，产率为68％。此化合物的氢谱为：1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.03(d,J＝6.4Hz,2H),7.84(d,J＝7.9Hz,2H),7.79(d,J＝6.0Hz,2H),7.59(d,J＝16.1Hz,1H),7.53(d,J＝7.9Hz,4H),6.85(d,J本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针，其特征在于，其结构式如式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针，其特征在于，其结构式如式I所示：简记为Mito-H2O2。2.一种权利要求1所述的线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：(1)将1eq的4-溴二乙胺基苯胺、0.1eq的醋酸钯和0.3eq的三(邻甲基苯基)磷溶于由Et3N和DMF按照体积比5:3组成的溶液中，在氮气保护的条件下将4eq的4-乙烯基吡啶注入上述溶液中，加热反应；用TCL板检测反应，反应完全后，分离提纯可得到化合物1，化合物1结构式如下所示：(2)将1eq的化合物1和1eq的对苄基溴频哪醇硼酸酯溶于乙腈中，氮气保护，加热回流反应，用TCL板检测反应，反应完全后，分离提纯可以得到目标化合物Mito-H2O2。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中加热反应温度为120℃，反应时间为14小时。4.根据权利要求2所述的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，任明光，周凯，邓贝贝，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37