锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种抗血清制备方法，具体为锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法及其应用，选健康锦鲤作为实验动物，取纯化的锦鲤疱疹病毒抗原，背部皮下多点注射，当血清效价达到顶峰时，心脏或尾静脉大量采血，分离血清，测效价，分装冷冻保存。获得的锦鲤疱疹病毒抗血清，用于检测KHV抗原，并可作为KHV抗体检测方法的阳性血清。本发明专利技术提供的锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法，建立了锦鲤抗KHV抗血清制备方法，获得了高效价抗血清，获得的抗血清可用于IFAT、ELISA等方法进行KHV抗原检测和作为阳性血清用于KHV抗体的检测。为国内开展KHV或KHV抗体免疫学诊断提供了程序化的抗血清制备方法，可提供成品化的免疫学诊断试剂。

Koi herpes virus antiserum preparation method and its application

The invention relates to a method for preparing specific antiserum, preparation method and application for Koi herpes virus antiserum, healthy Koi as experimental animal, the koi herpes virus antigen purification, subcutaneous multi-point injection, when the serum titer reached its peak when the heart or tail vein blood collection, separation of serum, test titer, packaging cryopreservation. Koi herpes virus antiserum obtained, for the detection of KHV antigen, and can be used as a method for detection of KHV antibody positive serum. Koi herpes virus antiserum preparation method provided by the invention, a koi anti KHV antiserum preparation method, obtained high titer antiserum antiserum can be used for the IFAT and ELISA methods to detect KHV antigen and positive serum as for the detection of KHV antibody. It provides a programmed antiserum preparation method for the immunological diagnosis of KHV or KHV antibodies in China, and can provide a finished immunological diagnostic reagent.

【技术实现步骤摘要】
锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法及其应用
本专利技术涉及一种抗血清制备方法，具体为锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法及其应用。
技术介绍
锦鲤疱疹病毒病(KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(KHV)感染引起的鲤鱼、锦鲤及其变种的一种传染性和急性病毒病。该病感染所有年龄段的鲤鱼和锦鲤，引起严重疾病和死亡，死亡率高达80％～90％。目前已知发生或进境鱼发生KHVD的国家和地区至少有22个，如奥地利、比利时、丹麦、法国、意大利、卢森堡、荷兰、波兰、瑞典、英国、中国、中国香港、中国台湾、印度尼西亚、日本、韩国、马来西亚、新加坡和泰国。其他地方，如南非和美国曾报道发生KHVD。锦鲤疱疹病毒病(KHVD)被世界动物卫生组织(OIE)列为鱼类必报疫病，并发布诊断标准(《水生动物疫病诊断手册》)，已多次改版，该病在我国《进境动物检疫疫病名录》中被列为二类传染病。该病诊断方法主要是用分子生物学方法，如PCR或实时定量PCR，或者在某些情况下用细胞培养分离病毒，但后者敏感性较差，而且OIE《水生动物疾病诊断手册》推荐至少使用2种方法监测和诊断KHV感染。但对于体内病毒含量非常低的病毒携带鱼，用上述方法进行检测则非常困难。因此研发出可用于检测鱼血清中KHV抗体的诊断试剂对于有效监测KHVD非常必要，特别是对于那些高价值的不能进行致死性诊断的观赏鱼(如锦鲤)尤为重要。根据国外已有文献报道，KHVD已建立多种免疫学诊断方法，并有商品化抗KHV血清。这些抗血清的制备主要分为两种方法获得：(1)通过克隆表达，获得病毒表达蛋白，免疫实验动物，获得抗血清；(2)直接对病毒进行纯化，获得抗原，用抗原免疫实验动物，获得抗血清。(3)通过以上两种方法获得表达蛋白或抗原，制备单克隆抗体。该技术仅在国外有相关研究，我国国内未有相关技术的研究；另外该技术免疫实验动物需要制备大量纯化抗原；相关抗血清等试剂均需要从国外进口，国内没有生产单位，进口成本高。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种成本低的锦鲤抗KHV抗血清制备方法。具体技术方案为：锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法，包括以下过程：(1)、免疫动物准备选健康锦鲤免疫动物，未接种过锦鲤疱症病毒病疫苗，体重为150～350g，体长15～25cm；接种前于室温环境下养殖不少于一周，定期少量喂食；接种前，尾静脉采血，分离血清，作为阴性血清，冷冻保存备用；(2)、免疫接种取纯化的锦鲤疱症病毒抗原，含量不低于1mg/mL，50℃水浴1min灭活，与等量不完全佐剂混合，背部皮下多点注射，每条鱼注射0.2mL；接种后，定期小量喂食，并保持水体环境；接种后第14天，尾静脉采血，分离血清测效价，每隔2周，采血测效价，剔除血清效价无变化的锦鲤；第10～12周，当血清效价达到顶峰时，心脏或尾静脉大量采血，分离血清，测效价，分装冷冻保存。所述的血清测效价的方法，为间接ELISA测血清效价，包括以下过程：用包被液将纯化的锦鲤疱症病毒抗原稀释至0.5μg/mL，加入酶标板，每孔100μL，37℃2h；包被液包括8.4g/L的NaHCO3、3.56g/L的Na2CO3，pH9.5；每孔加260μLPBST洗板3次，PBST的pH8.0；用含10％脱脂奶粉PBST分别将抗血清和阴性血清进行10倍倍比稀释，即分别为1：10、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200，每种血清每个稀释度加2孔，每孔100μL，25℃环境下1h，洗板3次；加入稀释兔抗鲤鱼IgM-HRP，每孔100μL，25℃环境下1h，洗板3次；每孔加入底物TMB溶液100μL，25℃孵育20min，每孔加入1N硫酸溶液100μL终止反应，酶标仪测量OD450；相同稀释度下，当抗血清OD450值不高于1.0，阴性血清OD450值不高于0.2，即为血清效价。纯化的锦鲤疱症病毒抗原，是通过密度梯度离心法或者沉淀法、分子筛法获得。本专利技术获得的锦鲤疱疹病毒抗血清，用于免疫印迹、IFAT、ELISA等方法检测KHV抗原，并可作为KHV抗体检测方法的阳性血清。目前，还没有用于免疫学检测KHV或KHV抗体的商品化试剂盒，本专利技术获得的抗血清也可用于组装上述方法的检测试剂盒。本专利技术提供的锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法，具有以下技术效果：(1)、抗血清制备简单获得纯化抗原后，一次性接种规定浓度抗原，不需要进行多次免疫，即可获得高效价血清。(2)、抗血清制备成本低使用抗原量少，节省大量抗原增殖、纯化的成本：浓度为1mg/mL纯化KHV抗原，与等量不完全弗氏佐剂混合后，取0.2mL接种锦鲤，抗原用量仅为0.1mg。接种程序简单，节省抗原用量和免疫佐剂：本技术方案只需要接种一次实验动物锦鲤，不需要多次接种。实验室动物易于获得、养殖成本低：本技术方案实验动物为锦鲤，相对于家兔、山羊、绵羊等实验动物，价格低，实验室养殖简单。(3)、制备的抗血清填补国内空白目前国内没有生产KHV抗血清的单位，基本依靠进口，成本高，不利于KHV免疫学诊断方法的推广使用，本专利提供了一种简单而有效的KHV抗血清制备方法。本专利技术提供的锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法，建立了锦鲤抗KHV抗血清制备方法，获得了高效价抗血清，获得的抗血清可用于IFAT、ELISA等方法进行KHV抗原检测和作为阳性血清用于KHV抗体的检测。为国内开展KHV或KHV抗体免疫学诊断提供了程序化的抗血清制备方法，可提供成品化的免疫学诊断试剂。附图说明图1是本专利技术的流程示意图。具体实施方式结合实施例说明本专利技术的具体实施方式。如图1所示，锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法：(1)、免疫动物准备选健康锦鲤免疫动物，来源于无锦鲤疱疹病毒病(KHVD)发病历史的养殖场，未接种过锦鲤疱症病毒病疫苗，体重为150～350g，体长15～25cm。接种前于室温环境下(水温不超过30℃)养殖不少于一周，定期少量喂食。接种前，尾静脉少量采血，分离血清，作为阴性血清，冷冻保存备用。为防止接种期间锦鲤出现死亡而无法获得抗血清，并考虑需要获得的血清量，接种锦鲤数量不少于4尾。(2)、免疫接种取密度梯度离心法纯化的锦鲤疱症病毒(KHV)抗原，含量不低于1mg/mL，50℃水浴1min灭活，与等量不完全佐剂混合，背部皮下多点注射，每条鱼注射0.2mL。接种后，定期小量喂食，并保持水体环境。接种后14天后，尾静脉少量采血，分离血清测效价，之后，每隔2周，采血测效价，期间密切注意血清效价变化情况，及时剔除血清效价无变化的锦鲤。约10～12周，血清效价达到顶峰(之后血清效价逐步下降)，当血清效价达到顶峰时，心脏或尾静脉大量采血，分离血清，测效价，分装冷冻保存。(3)、测效价为间接ELISA测血清效价如表1，用包被液(8.4g/LNaHCO3，3.56g/LNa2CO3，pH9.5)将密度梯度纯化KHV抗原稀释至0.5μg/mL，加入酶标板，每孔100μL，37℃2h。每孔加260μLPBST(pH8.0)洗板3次。用含10％脱脂奶粉PBST分别将抗血清和阴性血清(免疫前获得的血清)进行10倍倍比稀释(1：10、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200)，每种血清每个稀释度加2孔，每孔100μL，25℃1h，洗板3次。加入稀释兔抗鲤鱼IgM-HRP(本文档来自技高网...

【技术保护点】
锦鲤疱疹病毒抗血清，其特征在于，制备方法包括以下过程：(1)、免疫动物准备选健康锦鲤免疫动物，未接种过锦鲤疱症病毒病疫苗，体重为150～350g，体长15～25cm；接种前于室温环境下养殖不少于一周，定期少量喂食；接种前，尾静脉采血，分离血清，作为阴性血清，冷冻保存备用；(2)、免疫接种取纯化的锦鲤疱症病毒抗原，含量不低于1mg/mL，50℃水浴1min灭活，与等量不完全佐剂混合，背部皮下多点注射，每条鱼注射0.2mL；接种后，定期少量喂食，并保持水体环境；接种后第14天，尾静脉采血，分离血清测效价，每隔2周，采血测效价，剔除血清效价无变化的锦鲤；第10～12周，当血清效价达到顶峰时，心脏或尾静脉大量采血，分离血清，测效价，分装冷冻保存。

【技术特征摘要】
1.锦鲤疱疹病毒抗血清，其特征在于，制备方法包括以下过程：(1)、免疫动物准备选健康锦鲤免疫动物，未接种过锦鲤疱症病毒病疫苗，体重为150～350g，体长15～25cm；接种前于室温环境下养殖不少于一周，定期少量喂食；接种前，尾静脉采血，分离血清，作为阴性血清，冷冻保存备用；(2)、免疫接种取纯化的锦鲤疱症病毒抗原，含量不低于1mg/mL，50℃水浴1min灭活，与等量不完全佐剂混合，背部皮下多点注射，每条鱼注射0.2mL；接种后，定期少量喂食，并保持水体环境；接种后第14天，尾静脉采血，分离血清测效价，每隔2周，采血测效价，剔除血清效价无变化的锦鲤；第10～12周，当血清效价达到顶峰时，心脏或尾静脉大量采血，分离血清，测效价，分装冷冻保存。2.根据权利要求1所述的锦鲤疱疹病毒抗血清，其特征在于，所述的血清测效价的方法，为间接ELISA测血清效价，包括以下过程：用包被液将纯化的锦鲤疱症病毒抗原稀释至0.5μg/mL，加入酶标板，每孔100μL，37℃2h；包被液包括8.4g/L的NaHCO3、3.56g/L的Na2CO3，pH9....

【专利技术属性】
技术研发人员：周毅，段宏安，徐晔，丁超，王凤芝，曹洁，程积进，
申请(专利权)人：中华人民共和国连云港出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：江苏,32