一种禽肉中替米考星检测方法及检测卡技术

本发明专利技术公开了一种禽肉中替米考星检测方法及检测卡，检测卡制作包括如下步骤：S1，替米考星与卵清蛋白偶联物的制备，取20‑24mg替米考星、14‑16mgN，N’‑羧基二咪唑用1.4‑1.6ml N,N‑二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应1h，即可得到反应液，取卵清蛋白32‑40mg，使卵清蛋白充分溶解在3‑4ml 50mol/L碳酸钠溶液中，将反应液逐渐缓慢滴加到卵清蛋白溶液中，在室温中反应24‑30h，用0.01mol/L PBS透析3天，每天换液3‑4次。该禽肉中替米考星检测方法及检测卡，通过将所需的大部分原料整合到检测卡上，通过检测卡插入进微孔试剂中进行检测，大大缩短了检样时间，且样品无需特殊处理，等待4‑6mim即可得出结果，检测过程无需特殊仪器辅助，普通人员均可操作，不需要专业培训，极易使用。

Test method for detecting star in poultry meat and detection card

The invention discloses a poultry tilmicosin detection method and detection card card, which comprises the following steps: S1, tilmicosin and ovalbumin conjugates were prepared from 20 24mg tilmicosin, 14 16mgN, N 'two imidazole with 1.4 carboxyl 1.6ml N N, two formamide dissolved, stirring at room temperature 1H, reaction solution can be obtained, from 32 40mg to ovalbumin, ovalbumin fully dissolved in 3 4ml 50mol/L sodium carbonate solution, the reaction liquid slowly dripped into ovalbumin solution, 24 30h reaction at room temperature, with 0.01mol/L PBS in 3 days, the medium was changed every day 3 4. The poultry in tilmicosin detection method and detection card, integrated into the detection card through most of the raw materials will be required to detect, inserted into the microporous reagent by detecting card, greatly shorten the time of the sample, and the sample without special treatment, wait for 4 6mim results can be obtained, without special detection process the auxiliary instrument, the ordinary personnel can operate, without the need of professional training, very easy to use.

【技术实现步骤摘要】
一种禽肉中替米考星检测方法及检测卡
本专利技术涉及替米考星
，具体为一种禽肉中替米考星检测方法及检测卡。
技术介绍
替米考星是由泰乐菌素的一种水解产物半合成的畜禽专用抗生素，药用其磷酸盐，替米考星是20世纪80年代开发的半合成大环内酯类畜禽专用抗生素，分子量869.15。将泰乐菌素与3，5－二甲基哌啶反应生成替米考星碱，再加磷酸和水即形成磷酸替米考星，它是顺反异构体的混合物。替米考星是在研究泰乐菌素脱糖后进行醛基的胺化反应得到的一个活性很好的产物，该胺化反应采用以甲酸作催化剂的Wallach反应，能获得收率很高的替米考星。目前大多数替米考星检测都是采用高效液相色谱法进行检测，但这些方法过于繁琐，耗时较长，检测成本较高，不能满足快速检测的要求，为此提供一种禽肉中替米考星检测方法及检测卡。
技术实现思路
（一）解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种禽肉中替米考星检测方法及检测卡，解决了检测耗时长和检测成本高的问题。（二）技术方案为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种禽肉中替米考星检测卡，检测卡制作包括如下步骤：S1，替米考星与卵清蛋白偶联物的制备，取20-24mg替米考星、14-16mgN，N’-羧基二咪唑用1.4-1.6mlN,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应1h，即可得到反应液，取卵清蛋白32-40mg，使卵清蛋白充分溶解在3-4ml50mol/L碳酸钠溶液中，将反应液逐渐缓慢滴加到卵清蛋白溶液中，在室温中反应24-30h，用0.01mol/LPBS透析3天，每天换液3-4次，以出去未反应的小分子物质，最后以12000r/min离心25-35min，收集上清液，分别进行储存，放于-20℃保存备用；S2，人工抗原的鉴定，将替米考星、卵清蛋白、替米考星-卵清蛋白偶联物用PH7.4的PBS配成0.4-0.6mg/ml的溶液，以0.01mol/LPH7.4PBS调零，用紫外分光广度计在波长200-600范围内扫描，得到替米考星、卵清蛋白呵替米考星-卵清蛋白偶联物的吸收曲线，通过显示出三条不同的吸收曲线，表示替米考星与载体蛋白偶联成功；S3，替米考星单克隆抗体的制备，将替米考星-卵清蛋白偶联物注入Balb/c小鼠体内，使小鼠进行免疫，剂量为140-160μg/只，使其产生抗血清，取免疫Balb/c小鼠细胞，按8:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌替米考星单克隆抗体的替米考星单克隆再叫瘤细胞株，将杂交瘤细胞用冻存液制成5X106个/ml的细胞悬液，在液氨中长期保存，复苏时取出冻存管，放入到37℃水浴中速溶，离心取出冻存液后，移入培养瓶内培养，将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-包河硫酸铵法将得到的培养液进行钝化，得到单克隆抗体，-20℃保存；S4,羊抗鼠抗抗体的制备，以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；S5，胶体金的制备，用双蒸水离子水将1%氯金酸稀释成0.01%（质量百分含量），取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2-3ml1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存，制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物；S6，替米考星单克隆抗体-胶体金标记物的制备，在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的PH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入24μg的标准向胶体金溶液中加入上述替米考星单克隆抗体，搅拌均匀，室温静置8-12min，加入10%卵清蛋白，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%，静置8-12min，然后在12000r/min，4℃的温度下离心35-45min，弃掉上层清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两到三次，用体积为初始胶体金1/10的复溶缓冲液将沉淀重置，放在4℃下备用；S7，向微孔试剂微孔板中加入100μl替米考星单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有替米考星单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存；S8，反应膜的制备，用磷酸缓冲液将替米考星-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线，包被量为1.0μg/cm2,,然后用0.01mol/LPH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到160-240μg/ml，用点膜仪将其包被与硝酸纤维膜上的质控线，包被量为1.0μg/cm2，将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2-3h，备用，将样品吸收垫置于含0.5%卵清蛋白、PH7.20.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2-3h，37℃烘干2-3h备用；S9，样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜依次按顺序粘贴在底板上，样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测面，上面印有标记线，检测线含有替米考星-载体蛋白偶联物，质控线含有羊抗鼠抗抗体。优选的，所述复溶缓冲液含卵清蛋白0.05%-0.35%、吐温-800.02%-0.22%和PH7.2的0.02-0.03mol/L磷酸盐缓冲液。优选的，所述底板为PVC底板、样品吸收垫为吸滤纸、反应膜为硝酸纤维膜、吸水垫为吸水纸、保护膜为PE材质保护膜。优选的，所述仪器包括离心机、紫外分光广度计、培养瓶、细胞培养基、恒温电磁搅拌器、冷冻干燥机和点膜仪。优选的，所述复溶缓冲液含卵清蛋白0.1%-0.3%、吐温-800.05%-0.2%和PH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。一种禽肉中替米考星检测方法，滴加待检禽肉中样品溶液180-220μl到微孔试剂中，搅拌均匀后，在室温中培育4-6min，将检测卡标有标记线的一端向下插入培育的微孔试剂中，在室温培育4-6min，观察结果，替米考星在样本中的含量高于或等于检测卡对其的最低检测限时，替米考星单克隆抗体-胶体金标记物与替米考星结合，金标抗体上的抗原结合位点呗封闭，从而在检测线上因为竞争反应，不会与替米考星-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带，阴性样板在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带，阳性：质控线显示一条红色条带，而检测线不显色，检测卡以显示红色线一条，判定为阳性，阴性：质控线显示一条红色条带，检测线同时也显示出一条红色条带，检测卡以显示红色线两条，判定为阴性，当质控线不显示红色条带，则无论检测线显示出红色与否，都判定检测卡为无效。（三）有益效果本专利技术提供了一种禽肉中替米考星检测方法及检测卡，具备以下有益效果：（1）该禽肉中替米考星检测方法及检测卡，通过将所需的大部分原料整合到检测卡上，通过检测卡插入进微孔试剂中进行检测，大大缩短了检样时间，且样品无需特殊处理，等待4-6mim即可得出结果，检测过程无需特殊仪器辅助，普通人员均可操作，不需要专业培训，极易使用。（2）该禽肉中替米考星检测方法及检测卡，建构简单，生产成本低廉，检测准确率高，从而可以极大的提高青霉素的检测率，以及节约检测成本。具体实施方式基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种禽肉中替米考星检测卡，其特征在于：检测卡制作包括如下步骤：S1，替米考星与卵清蛋白偶联物的制备，取20‑24mg替米考星、14‑16mgN，N’‑羧基二咪唑用1.4‑1.6ml N,N‑二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应1h，即可得到反应液，取卵清蛋白32‑40mg，使卵清蛋白充分溶解在3‑4ml 50mol/L碳酸钠溶液中，将反应液逐渐缓慢滴加到卵清蛋白溶液中，在室温中反应24‑30h，用0.01mol/L PBS透析3天，每天换液3‑4次，以出去未反应的小分子物质，最后以12000r/min离心25‑35min，收集上清液，分别进行储存，放于‑20℃保存备用；S2，人工抗原的鉴定，将替米考星、卵清蛋白、替米考星‑卵清蛋白偶联物用PH7.4的PBS配成0.4‑0.6mg/ml的溶液，以0.01mol/L PH7.4PBS调零，用紫外分光广度计在波长200‑600范围内扫描，得到替米考星、卵清蛋白呵替米考星‑卵清蛋白偶联物的吸收曲线，通过显示出三条不同的吸收曲线，表示替米考星与载体蛋白偶联成功；S3，替米考星单克隆抗体的制备，将替米考星‑卵清蛋白偶联物注入Balb/c小鼠体内，使小鼠进行免疫，剂量为140‑160μg/只，使其产生抗血清，取免疫Balb/c小鼠细胞，按8:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌替米考星单克隆抗体的替米考星单克隆再叫瘤细胞株，将杂交瘤细胞用冻存液制成5X10...

【技术特征摘要】
1.一种禽肉中替米考星检测卡，其特征在于：检测卡制作包括如下步骤：S1，替米考星与卵清蛋白偶联物的制备，取20-24mg替米考星、14-16mgN，N’-羧基二咪唑用1.4-1.6mlN,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应1h，即可得到反应液，取卵清蛋白32-40mg，使卵清蛋白充分溶解在3-4ml50mol/L碳酸钠溶液中，将反应液逐渐缓慢滴加到卵清蛋白溶液中，在室温中反应24-30h，用0.01mol/LPBS透析3天，每天换液3-4次，以出去未反应的小分子物质，最后以12000r/min离心25-35min，收集上清液，分别进行储存，放于-20℃保存备用；S2，人工抗原的鉴定，将替米考星、卵清蛋白、替米考星-卵清蛋白偶联物用PH7.4的PBS配成0.4-0.6mg/ml的溶液，以0.01mol/LPH7.4PBS调零，用紫外分光广度计在波长200-600范围内扫描，得到替米考星、卵清蛋白呵替米考星-卵清蛋白偶联物的吸收曲线，通过显示出三条不同的吸收曲线，表示替米考星与载体蛋白偶联成功；S3，替米考星单克隆抗体的制备，将替米考星-卵清蛋白偶联物注入Balb/c小鼠体内，使小鼠进行免疫，剂量为140-160μg/只，使其产生抗血清，取免疫Balb/c小鼠细胞，按8:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌替米考星单克隆抗体的替米考星单克隆再叫瘤细胞株，将杂交瘤细胞用冻存液制成5X106个/ml的细胞悬液，在液氨中长期保存，复苏时取出冻存管，放入到37℃水浴中速溶，离心取出冻存液后，移入培养瓶内培养，将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-包河硫酸铵法将得到的培养液进行钝化，得到单克隆抗体，-20℃保存；S4,羊抗鼠抗抗体的制备，以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；S5，胶体金的制备，用双蒸水离子水将1%氯金酸稀释成0.01%（质量百分含量），取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2-3ml1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存，制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物；S6，替米考星单克隆抗体-胶体金标记物的制备，在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的PH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入24μg的标准向胶体金溶液中加入上述替米考星单克隆抗体，搅拌均匀，室温静置8-12min，加入10%卵清蛋白，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%，静置8-12min，然后在12000r/min，4℃的温度下离心35-45min，弃掉上层清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两到三次，用体积为初始胶体金1/10的复溶缓冲液将沉淀重置，放在4℃下备用；S7，向微孔试剂微孔板中加入100μl替米考星单克隆抗体-胶体...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵春城，徐静，吴敏芳，胡勇，蒋韦艳，刘金杰，
申请(专利权)人：无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32