一种纤维蛋白原定量检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种纤维蛋白原定量检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠、辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体、发光化学底物和终止液，所述试剂盒还包括用于防止磁珠聚集的分散剂，所述分散剂包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。本发明专利技术具有分析灵敏度高、特异性好、准确度高、成本低等优点，且使因磁珠的聚集导致试剂盒灵敏度降低的问题得到了解决。

Fibrinogen quantitative detection kit and detection method

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a fibrinogen quantitative detection kit and detection method, the kit includes anti fibrinogen polyclonal antibody coated beads, horseradish peroxidase labeled anti fibrinogen polyclonal antibody, chemiluminescence substrate and termination of liquid, the kit also to prevent the aggregation of magnetic beads including dispersing agent, the dispersing agent including amino acid 0.06 - 2, 0.5 - 2 acetic acid and carboxymethyl dextran 2 to 5 copies. The invention has the advantages of high sensitivity, good specificity, high accuracy and low cost, and solves the problem that the sensitivity of the reagent box is reduced because of the aggregation of the magnetic beads.

【技术实现步骤摘要】
一种纤维蛋白原定量检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种纤维蛋白原定量检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
纤维蛋白原(FIB)是一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，是纤维蛋白的前体，分子量340000，半衰期4～6日，血浆中参考值2～4克/升。纤维蛋白原由α、β、γ三对不同多肽链所组成，多肽链间以二硫键相连。目前研究表明FIB不仅在凝血、血小板凝集、纤溶以及动脉粥样硬化等过程起着至关重要的作用，还与结直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢上皮癌、肝细胞肝癌及尿路上皮癌等肿瘤的发生进展、转移及预后密切相关，其作为肿瘤生物标志物的可行性越来越受人们的重视。纤维蛋白原的检测方法多达数十种，按原理分为三类:热/盐沉淀法，可凝固蛋白法和免疫法。热盐沉淀法将血浆用PH6.3.KH2PO4-NaOH缓冲液稀释后，加热56℃，使纤维蛋白原凝集而呈现浊度，用比浊法测定其含量。此类方法是根据蛋白质的理化特性而建立的，特异性不高，影响因素多，血浆中其他蛋白影响其测定，所以结果往往偏高。免疫学法是以被测物质(纤维蛋白原)作为抗原，然后用免疫动物的方法制备相应的抗体，利用抗原抗体的特异性结合反应来对被检测物质进行定量。它包括免疫扩散法、免疫电泳酶联免疫吸附实验和免疫比浊等。此法特异性不强，因为这些方法所针对的纤维蛋白原的抗原决定簇也存在于纤维蛋白单体、纤维蛋白(原)降解产物(FDPs)和异常纤维蛋白原中。磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法，抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统ELISA法相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。但是由于磁珠粒度小，比表面积大，表面能大，细微的颗粒都趋向于聚集在一起，很容易团聚，这种聚集现象在加入待测样品后似乎更为明显。似乎是待测样品中的某些物质可以引起固体载体的非特异性聚集或降低免疫反应，从而严重影响测试，当用全血作为待测样本时，固体载体变成了容易在反应容器内部上聚集，从而影响了测试的灵敏度。另外，在利用磁微粒分离酶联免疫检测技术对纤维蛋白原含量进行测定时，需要用稀释液将待测样品稀释，但是该稀释液成本较高，不利于降低成本。因此，有必要提供一种分析灵敏度高、特异性好、准确度高的试剂盒，其解决了因磁珠的聚集导致试剂盒灵敏度降低的问题。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种用于检测纤维蛋白原的试剂盒，该试剂盒具有分析灵敏度高、特异性好、准确度高、成本低等优点，且使因磁珠的聚集导致试剂盒灵敏度降低的问题得到了解决。本专利技术提供了一种用于检测纤维蛋白原的试剂盒，所述试剂盒包括抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠、辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体、发光化学底物和终止液。为了达到前面所述的目的，本专利技术的专利技术人进行了各种研究。发现，将含有分散剂的待测样品进行测试，其可以防止磁珠的相互聚集，且其不会降低免疫反应。除外，分散剂在将抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠和待测样品混合时加入也可以达到前面所述的效果。值得说明的是，分散剂可以以任何浓度加入，只要他们以这样的浓度加入，可以发挥前面所述的效果即可。具体地说，当分散剂加入到样本中时，按照0.01～5μg/μl的浓度加入，优选是0.6～2μg/μl；当分散剂在将抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠和待测样品混合时加入，按照0.1～10μg/μl的浓度加入，优选是2～5μg/μl。在本专利技术中，分散剂优选包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。更优选地，所述分散剂包括氨基酸0.15份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份。优选地，所述氨基酸选自甘氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸中的一种。更优选地，氨基酸选自甘氨酸。优选地，所述发光化学底物为AMPPD，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，所述磁珠的内核为四氧化三铁，其粒径为0.3～1.0μm。优选地，所述抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠由以下步骤制得：a)将磁珠用MES缓冲液分散，使磁珠的终浓度为50～80mg/mL；b)用三倍磁珠溶液体积的MES缓冲液清洗磁珠两次后，再用MES缓冲液重新分散磁珠，使磁珠的终浓度为12～24mg/mL；c)取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于步骤b)所得的磁珠溶液中，搅拌反应后再向反应体系中加入抗纤维蛋白原多克隆抗体溶液，搅拌混匀，室温下搅拌过夜；d)将磁珠与反应体系分离后用MES缓冲液洗涤磁珠两次，再用MES缓冲液重新分散磁珠，磁珠的终浓度为25～45mg/mL；向重新分散后的磁珠溶液中加入1％BSA封闭液，室温封闭2～4小时，将磁珠与反应体系分离；再用pH7.4的Tris-HCl缓冲液清洗磁珠两次后用pH7.4的Tris-HCl缓冲液分散磁珠，使磁珠的终浓度为8～22mg/mL，得到所述抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠；所述辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体由以下步骤制得：S1、将辣根过氧化物酶溶解于蒸馏水中，加入0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌，得到混合溶液；将得到的混合溶液装入透析袋中用醋酸钠缓冲液透析过夜；S2、向透析液中加入碳酸盐缓冲液至pH值为8.5～9.0，加入抗纤维蛋白原多克隆抗体，混匀，室温下避光搅拌反应；S3、向所述步骤S2得到的反应产物中加入NaBH4溶液，混匀，静置反应，将反应得到的反应产物装入透析袋中于PBS缓冲液中搅拌过夜后取出，在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，静置，离心，弃上清；将沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤后，将沉淀物溶于PBS缓冲液中后装入透析袋中透析去除铵离子后，将溶液离心，去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等体积甘油后混匀分装，冰冻保存。优选地，所述试剂盒还包括纤维蛋白原标准品、样品稀释液和洗涤液PBST。一般在测试前，需要将血浆进行稀释。由于目前的血浆稀释液价格昂贵，不利于降低成本。专利技术人经过长期的试验研究，终于研究出一种新的血浆稀释液，其为含有0.2～2mg/ml的甘油和0.05～0.8mg/ml的β-巯基乙醇的质量分数为0.9％的生理盐水。更优选地，所述样品稀释液为含有1.5mg/ml的甘油和0.08mg/ml的β-巯基乙醇的质量分数为0.9％的生理盐水。该样品稀释液的效果比预想中的好，其与市场上的血浆稀释液所测各标本的结果差异无显著性，两组稀释液的结果之间具有较好的一致性。以血浆稀释液为参照，本专利技术样品稀释液89.3％，特异性为82.6％，准确度为88.9％，，由此可见，用本专利技术样品稀释液替代现有的血浆稀释液具有一定的可行性。相应地，本专利技术还提供了一种利用上述的试剂盒检测纤维蛋白原的方法，包括以下步骤：A)用样品稀释液将待检样品稀释至10～15μg/ml，取上述稀释后的待测样品于反应杯中，加入抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠，室温孵育20～30min后，加入辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体，室温孵育20～30min；B)分离磁珠，并用洗涤液洗涤后加入发光化学底物，作用10～30min，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纤维蛋白原定量检测试剂盒，所述试剂盒包括抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠、辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体、发光化学底物和终止液，其特征在于，所述试剂盒还包括用于防止磁珠聚集的分散剂，所述分散剂包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。

【技术特征摘要】
1.一种纤维蛋白原定量检测试剂盒，所述试剂盒包括抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠、辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体、发光化学底物和终止液，其特征在于，所述试剂盒还包括用于防止磁珠聚集的分散剂，所述分散剂包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述分散剂包括氨基酸0.15份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份。3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述氨基酸选自甘氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸中的一种。4.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光化学底物为AMPPD，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，所述磁珠的内核为四氧化三铁，其粒径为0.3～1.0μm。5.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠由以下步骤制得：a)将磁珠用MES缓冲液分散，使磁珠的终浓度为50～80mg/mL；b)用三倍磁珠溶液体积的MES缓冲液清洗磁珠两次后，再用MES缓冲液重新分散磁珠，使磁珠的终浓度为12～24mg/mL；c)取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于步骤b)所得的磁珠溶液中，搅拌反应后再向反应体系中加入抗纤维蛋白原多克隆抗体溶液，搅拌混匀，室温下搅拌过夜；d)将磁珠与反应体系分离后用MES缓冲液洗涤磁珠两次，再用MES缓冲液重新分散磁珠，磁珠的终浓度为25～45mg/mL；向重新分散后的磁珠溶液中加入1％BSA封闭液，室温封闭2～4小时，将磁珠与反应体系分离；再用pH7.4的Tris-HCl缓冲液清洗磁珠两次后用pH7.4的Tris-HCl缓冲液分散磁珠，使磁珠的终浓度为8～22mg/mL，得到所述抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠；所述辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体由以下步骤制得：S1、将辣根过氧化物酶溶解于蒸馏水中，加入0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌，得到混合溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立国，邹伟权，张亚丽，李庆祥，母润红，王涛，苏焱，
申请(专利权)人：广州华弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44