提高免疫试剂检测特异性的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种免疫检测的方法，所述方法先利用胃蛋白酶处理鼠源单克隆抗体，再利用经处理得到的鼠源单克隆抗体进行免疫检测。本发明专利技术的免疫检测方法显著减少免疫检测的假阳性结果。同时，配套使用本发明专利技术的稀释液，可进一步降低假阳性样本的检测值，同时提高经处理的鼠源单克隆抗体标记物在工作浓度保存时的生物学稳定性。所述稀释液是4‑羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其中含有酪蛋白、硫酸镁和复合酶稳定剂DPD，以氢氧化钠溶液调整pH至7.0～8.0。

Method for improving specificity of immunological reagent detection and application thereof

The present invention provides a method for immunoassay, which uses pepsin to treat murine monoclonal antibodies, and then uses monoclonal antibodies obtained from the treated mice to perform immunoassay. The immunoassay method of the invention significantly reduces false positive results of immunoassay. At the same time, the dilution of the invention can further reduce the detection value of the false positive sample, and improve the biological stability of the processed rat monoclonal antibody marker at the working concentration preservation. The diluent is 4 HEPES buffer, containing casein, Magnesium Sulfate and compound enzyme stabilizer DPD, sodium hydroxide solution to adjust pH to 7 ~ 8.

【技术实现步骤摘要】
提高免疫试剂检测特异性的方法及其应用
本专利技术涉及体外诊断试剂领域。具体地说，本专利技术涉及提高免疫试剂检测特异性的方法及其应用。
技术介绍
体外诊断试剂指用于对人体样本(各种体液、细胞、组织样本等)进行体外检测的试剂、试剂盒、校准品(物)、质控品(物)等，其检测结果对临床诊断及医生的用药处方有非常重要的提示作用。在体外诊断试剂中，以双抗体夹心为技术基础的免疫学方法是一种非常常用的检测抗原的方法，广泛应用于酶联免疫法、胶体金法、化学发光法试剂中。而在各种双抗体夹心法检测试剂的原料中，犹以鼠源单克隆抗体(以下简称鼠单抗)应用最为广泛。该种抗体应用优势非常明显：技术成熟、生产得到的抗体特异性高、批间差异小、成本较低、可比较方便地放大生产。但该种方法也面临一些特殊样本的挑战。例如，某些患者其本身体内并没有被测项目的物质，因生活环境中有鼠类出没，或因接受单克隆抗体治疗，在其血液或体液样本中可能含有人抗鼠抗体(即HAMA)，此类抗体在双鼠单抗夹心法的检测系统中可联接捕获抗体和标记抗体，从而产生阳性结果，即假阳性结果。同样的情况还会出现在某些自身免疫疾病患者的样本中。例如，类风湿关节炎患者的体内含有类风湿因子(RF)也能够联接捕获抗体和标记抗体，从而产生假阳性结果。而此类假阳性结果均有可能对临床诊断和医生处方造成一定的误导，并导致不能够对症下药或是贻误病情。对于双鼠单抗，即，捕获抗体与标记抗体均是鼠源单克隆抗体易引起假阳性的问题，业内已有关注，并提供了如下所述的多种解决方案。但目前看来，各方案均有各自缺陷，具体是：1.使用其他种属动物的多克隆抗体替代其中一株鼠单抗。但多克隆抗体的特异性往往差于单克隆抗体，且多克隆抗体不同批次之间的一致性会较单克隆抗体更差，因此在大规模生产时会有比较大的风险。2.使用其他种属动物的单克隆抗体替代其中一株鼠单抗。目前有公开报道的除了鼠源单克隆抗体还有兔源单克隆抗体，但兔单抗的制备工艺并不成熟，目前只有少数公司拥有该种抗体的生产能力，且价格非常昂贵。3.在试剂中添加更高浓度的无关游离鼠单抗通过竞争抑制的方法降低检测值。该方法价格便宜，但并不能完全消除样本带来的假阳性。4.部分公司可以提供与无关游离鼠单抗结构类似或是在此基础上加工而成的阻断物质，添加在试剂中通过竞争抑制的方法起到降低检测值的作用。该方法是目前使用最普遍的方法，但其中也有相当大的风险存在。首先，商品化的阻断物质其成分组成并不完全公开，其保密的组分在试剂中是否会对其他类型的特殊样本检测结果有影响尚不得而知。其次，商品化的阻断物质只对部分特殊样本有效。再者，这样的阻断物质往往比较昂贵且用量较大，不利于试剂生产企业大规模生产时的成本控制。综上所述，在双单抗夹心法测抗原为反应体系的免疫检测试剂中，如遇到样本中含有HAMA或RF，则极易产生假阳性结果，给临床诊断及医生处方带来一定的困扰。而目前业内常用的解决方案或是性能较差，对诊断试剂性能有影响；或是工艺不成熟，无法稳定重复生产；或是成本偏高，对企业负担较大。因此，本领域急需一种提高单克隆抗体在免疫类体外诊断试剂应用中的特异性，从而减少假阳性结果产生的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种免疫检测的方法，所述方法能够提高单克隆抗体在免疫类体外诊断试剂应用中的特异性，从而减少假阳性结果产生。在第一方面，本专利技术提供一种免疫检测的方法，所述方法包括以下步骤：(a)利用胃蛋白酶处理鼠源单克隆抗体；和(b)利用经过步骤(a)处理得到的鼠源单克隆抗体进行免疫检测。在具体的实施方式中，在步骤(a)和步骤(b)之间还包括对经过步骤(a)处理的鼠源单克隆抗体进行可检测标记的步骤。在优选的实施方式中，利用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、金颗粒、吖啶酯、免疫荧光标记物；更优选辣根过氧化物酶进行可检测标记。在具体的实施方式中，所述步骤(b)是将经过步骤(a)处理得到的鼠源单克隆抗体与稀释液混合，然后用于免疫检测；其中所述稀释液是以氢氧化钠溶液调整pH至7.0～8.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其中含有酪蛋白、硫酸镁和复合酶稳定剂DPD。在第二方面，本专利技术提供一种稀释液，所述稀释液是4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其中含有酪蛋白、硫酸镁和复合酶稳定剂DPD，以氢氧化钠溶液调整pH至7.0～8.0。在第三方面，本专利技术提供一种免疫检测试剂，所述免疫检测试剂包含经过胃蛋白酶处理的鼠源单克隆抗体。在具体的实施方式中，所述免疫检测试剂还包含本专利技术第二方面所述的稀释液。在第四方面，本专利技术提供经过胃蛋白酶处理的鼠源单克隆抗体或本专利技术第二方面所述的稀释液在制备免疫检测试剂盒或免疫检测试剂中的应用。在第五方面，本专利技术提供一种免疫检测试剂盒，所述试剂盒装有经过胃蛋白酶处理的鼠源单克隆抗体。在具体的实施方式中，所述试剂盒还装有权利要求4所述的稀释液。在优选的实施方式中，所述试剂盒还装有使用说明书。在第六方面，本专利技术提供一种免疫检测方法，所述方法包括利用本专利技术第三方面所述的免疫检测试剂或本专利技术第五方面所述的免疫检测试剂盒进行免疫检测。在优选的实施方式中，所述免疫检测方法可以是非诊断目的的。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了鼠源单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图谱，所述鼠源单克隆抗体经胃蛋白酶处理并经凝胶过滤层析纯化以及分段收集。其中，M泳道为高分子Marker，分子量由上往下依次是97.2KD，66.4KD，44.3KD，29.0KD，20.1KD；1-6号泳道为凝胶过滤层析时不同时间收集的抗体；7号泳道为完整鼠源单克隆抗体；8号泳道为经试验验证有较好检测结果的抗体留样；9号泳道为经胃蛋白酶处理后未经凝胶过滤纯化的抗体。具体实施方式专利技术人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现利用特定的蛋白酶处理鼠源单克隆抗体后可以显著减少免疫检测的假阳性结果；同时配套使用本专利技术的稀释液，可进一步降低假阳性样本的检测值，同时提高经处理的鼠源单克隆抗体标记物在工作浓度保存时的生物学稳定性。在此基础上完成了本专利技术。本专利技术的术语本文所用的术语具有与本领域普通技术人员常规理解相同或相似的含义。例如，HAMA是指人抗鼠抗体(HumanAntiMouseAntibody)；HAMA效应是指因人抗鼠抗体引起的假阳性；RF是指类风湿因子(RheumatoidFactor)；S/COV是指样本检测值与临界值(CutOffValue)的比值，用于对样本进行定性判断。本专利技术的提高免疫试剂检测特异性的方法为解决采用双鼠单抗夹心法进行免疫检测易产生假阳性结果的缺陷，本专利技术人创造性地利用特定的蛋白酶处理鼠源单克隆抗体，从而显著减少采用双鼠单抗夹心法进行免疫检测产生的假阳性结果。在本专利技术的具体的实施方式中，利用胃蛋白酶对单克隆抗体进行处理，将经处理的鼠源单克隆抗体用于双鼠单抗夹心法免疫检测，显著减少了产生的假阳性结果。进一步地，可以纯化得到经处理的鼠源单克隆抗体。在具体的实施方式中，本专利技术提供一种纯化加工鼠单抗的方法，包括：在酸性缓冲液环境中，利用胃蛋白酶对鼠源单克隆抗体进行处理，使用凝胶过滤层析对处理后的鼠源单克隆抗体溶液进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫检测的方法，所述方法包括以下步骤：(a)利用胃蛋白酶处理鼠源单克隆抗体；和(b)利用经过步骤(a)处理得到的鼠源单克隆抗体进行免疫检测。

【技术特征摘要】
1.一种免疫检测的方法，所述方法包括以下步骤：(a)利用胃蛋白酶处理鼠源单克隆抗体；和(b)利用经过步骤(a)处理得到的鼠源单克隆抗体进行免疫检测。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)和步骤(b)之间还包括对经过步骤(a)处理的鼠源单克隆抗体进行可检测标记的步骤。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)是将经过步骤(a)处理得到的鼠源单克隆抗体与稀释液混合，然后用于免疫检测；其中所述稀释液是以氢氧化钠溶液调整pH至7.0～8.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其中含有酪蛋白、硫酸镁和复合酶稳定剂DPD。4.一种稀释液，所述稀释液是4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其中含有酪蛋白、硫酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏泽，张巍佳，沈丹，李基，
申请(专利权)人：上海科华生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31