一种检测病原微生物的方法技术

本发明专利技术属于纳米生物技术检测领域，具体是指一种基于噬菌体表面展示多肽配体和仿酶纳米材料检测病原微生物的方法。利用多功能生物纳米探针与待检测靶标病原微生物进行孵育，而后在显色体系下即可实现对其检测；其中，多功能生物纳米探针为利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与病原微生物特异性结合的噬菌体单克隆，再进一步分离纯化获得展示有特异性多肽的噬菌体相应位点的蛋白；而后展示有特异性多肽的噬菌体衣壳蛋白组装于仿酶纳米材料上。本发明专利技术探针不仅能特异性识别和结合靶标微生物，又因其仿酶活性可实现信号放大，从而实现副溶血弧菌的免疫比色定量检测。该方法操作简单、成本低廉、特异性和灵敏度均较高，为实现致病微生物的灵敏检测提供了一条有效途径。

Method for detecting pathogenic microorganism

The invention belongs to the field of nanometer biological technology detection, in particular to a method for detecting pathogenic microorganisms based on phage surface display polypeptide ligands and biomimetic nano materials. The multifunctional bio nano probe and the detection of target pathogens were incubated in the color system can realize the detection; the multifunctional bio nano probe for the use of bio panning technique combined with selected pathogenic microorganism specific monoclonal phage landscape from the phage library, further isolated display specific the corresponding peptide phage sites for protein purification; then show specific peptide phage capsid assembly in biomimetic nano materials. The probes of the invention not only can identify and combine target microorganisms specifically, but also can amplify signals because of their enzymatic activity so as to realize the quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus by immune colorimetry. The method is simple, low cost, high specificity and sensitivity. It provides an effective way for sensitive detection of pathogenic microorganisms.

【技术实现步骤摘要】
一种检测病原微生物的方法
本专利技术属于纳米生物技术检测领域，具体是指一种基于噬菌体表面展示多肽配体和仿酶纳米材料组装成多功能生物纳米探针检测病原微生物的方法。
技术介绍
病原微生物是指可直接或间接造成人、动物损害的生物，种类繁多且对人类感染十分普遍，几乎威胁到每一个人。由食源性致病微生物造成的食源性疾病是目前对人类及社会最为常见的一种威胁。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是在公共医疗保健体系中全球最普遍的病原体之一，同时也是污染普通食品和水产品的最主要微生物。由这种病原微生物引起的食源性疾病，如食物中毒、肠胃炎、败血症、中毒性休克综合征等致命性疾病，是目前国内外医疗体系的至关重要的难题。传统检测病原微生物的方法主要依靠具体微生物学、生物化学和分子生物技术，如平板培养法和PCR法。这些传统方法虽然灵敏度和特异性都比较好，但是检测需要的时间比较长(一般需要3-7天)，因而并不适用于现场的快速检测。目前研究者已开发多种具有高灵敏度和特异性的快速检测方法，主要可分为以免疫学为基础的方法和基于生物传感器的方法。这两种方法的特点和难点均是选择可特异性识别和结合靶标微生物的抗体。但是，抗体分子具有制备复杂、造价昂贵、稳定性差等缺点，这极大地限制了其在生物领域中的广泛应用。因此，开发实用性广、廉价、可再生、稳定性强、特异性好的靶向特异性配体成为必然。特异性多肽具有稳定性高、分子量小、特异性高、易合成等优点，成为新型靶向试剂。噬菌体展示技术可以将外源随机多肽展示于噬菌体衣壳蛋白的表面，构建的噬菌体展示文库通过高通量筛选获得靶标特异性多肽配体。纳米酶是具有仿酶活性的纳米材料，其本质是一种化学催化剂。纳米酶具有价廉、稳定性高、表面积大、催化活性强等优势。目前，纳米酶的研究已成为近几年相关领域中的热点方向。过渡金属氧化物纳米酶是目前研究最为广泛的一种纳米酶。因其具有独特的理化性能，纳米酶在催化工业、生物医药、检测、环境保护等领域具有广阔的应用前景。综上所述，急需一种可特异性结合靶标微生物的多肽配体来实现靶标微生物的特异性识别和结合，同时急需一种具有优良仿酶活性的纳米酶实现信号放大，将二者有效结合，实现病原微生物的灵敏、特异、快速检测。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种基于噬菌体表面展示多肽配体和仿酶纳米材料制备多功能生物纳米探针检测病原微生物的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种检测病原微生物的方法，利用多功能生物纳米探针与待检测靶标病原微生物进行孵育，而后在显色体系下即可实现对其检测；其中，多功能生物纳米探针为采用噬菌体主要衣壳蛋白pVIII为模板合成仿酶纳米材料；而后利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与病原微生物特异性结合的噬菌体单克隆，再进一步分离纯化获得展示有特异性多肽的噬菌体主要衣壳蛋白；而后展示有特异性多肽的噬菌体衣壳蛋白组装于仿酶纳米材料上。从而构建一种多功能生物纳米探针。该探针不仅能特异性识别和结合靶标微生物，又因其仿酶活性可实现信号放大，从而实现靶标病原微生物的定量检测。所述多功能生物纳米探针的制备如下，采用蛋白模板法合成仿酶纳米材料二氧化锰；而后利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与副溶血弧菌特异性结合的噬菌体单克隆，再进一步纯化获得展示有特异性多肽的噬菌体衣壳蛋白pVIII(fusionpVIII)，再将fusionpVIII组装在二氧化锰材料的表面从而构建检测副溶血弧菌的多功能生物纳米探针。该探针不仅能特异性识别和结合靶标微生物，又因其仿酶活性可实现信号放大，从而实现副溶血弧菌的免疫比色定量检测。其中，二氧化锰仿酶纳米材料是具有仿过氧化物酶活性的MnO2纳米片(MnO2NSs)。所述多功能生物纳米探针的构建如下，首先利用氨基甲酸叔丁酯(BOC)保护fusionpVIII的具有与副溶血弧菌结合活性的N端，然后将其C端用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，将fusionpVIII组装在二氧化锰仿酶纳米片表面pVIII蛋白残基后加入三氟乙酸将fusionpVIII去BOC保护，使得其N端恢复与副溶血弧菌特异性结合的活性，即可。所述噬菌体表面展示多肽配体以病原微生物副溶血弧菌为靶标，利用生物淘选技术从风景噬菌体f8/9文库进行淘选，生物淘选技术共经过3轮严格的淘选过程，并通过特异性测试，成功获得能够特异性识别副溶血弧菌的噬菌体单克隆。进一步大量扩增噬菌体并通过饱和酚分离纯化展示有特异性多肽的噬菌体fusionpVIII。所述多功能生物纳米探针是通过酰胺键将fusionpVIII的C端与二氧化锰材料表面蛋白残基的N端相互作用构建得到的。所述多功能生物纳米探针的构建过程中fusionpVIII与二氧化锰材料的摩尔比例为1000:1。所述检测副溶血弧菌首先将fusionpVIII固定于96孔板中，BSA封闭1h，PBS缓冲液洗涤后副溶血弧菌静置孵育，然后加入上述多功能二氧化锰纳米探针孵育，孵育条件为37℃静置孵育1h，用PBS缓冲液洗涤后加入显色液反应；其中，fusionpVIII在96孔板中的固定量和固定浓度为100μl、40μg/ml。所述显色体系为140μl乙酸-乙酸钠缓冲液(10mM，pH4)、20μl10mMH2O2和20μl6mM四甲基联苯胺(TMB)。本专利技术的有益效果为：本专利技术采用生物淘选技术从噬菌体文库中淘选得到可特异性识别和结合副溶血弧菌的噬菌体多肽配体；并采用具有较高仿过氧化物酶活力的二氧化锰纳米材料，因其可催化过氧化物酶底物产生明显的显色反应而实现信号放大。本专利技术将噬菌体多肽配体组装在二氧化锰纳米材料的表面构建得到既可特异性识别和结合副溶血弧菌，又可实现信号放大的多功能纳米探针，实现了副溶血弧菌的灵敏特异检测，具有十分重要的现实意义。具体是：1、本专利技术采用生物淘选技术从噬菌体文库中淘选得到副溶血弧菌的高亲和性和高特异性的噬菌体九肽配体VQTVQIGSD。该多肽配体稳定性高、分子量小、特异性高、易合成。2、本专利技术采用BOC保护、EDC/NHS活化将副溶血弧菌特异性结合噬菌体fusionpVIII组装在MnO2NSs的表面，构建得到一种新颖多功能纳米探针。该探针不仅可以特异性识别靶标微生物副溶血弧菌，又可因其仿过氧化酶活性实现信号放大。3、本专利技术方法副溶血弧菌的检出限为15cfu/mL，低于迄今报道的其他方法的检出限。所提出的方法具有检测范围宽、选择性好、价格低廉，适用于真正的海洋样品测量的优势，在环境化学，生物技术，生物技术，催化工业和生物评价领域开辟了一条有前景的检测方法。附图说明图1为本专利技术实施例提供的检测副溶血弧菌示意图，包括多功能纳米探针的构筑过程：fusion-pVIII的BOC保护(A)，EDC/NHS活化fusion-pVIII的C端、与MnO2NSs组装、fusion-pVIII的N端去BOC保护(B)，检测副溶血弧菌流程图(C)。图2为本专利技术实施例提供的三轮生物淘选的回复率。图3为本专利技术实施例提供的挑选的三种噬菌体单克隆特异性测试结果。图4为本专利技术实施例提供的检测副溶血弧菌工作曲线。图5为本专利技术实施例提供的检测副溶血弧菌特异性测试结果。具体实施方式下面通过实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测病原微生物的方法，其特征在于：利用多功能生物纳米探针与待检测靶标病原微生物进行孵育，而后在显色体系下即可实现对其检测；其中，多功能生物纳米探针为利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与病原微生物特异性结合的噬菌体单克隆，再进一步纯化获得离纯化展示有特异性多肽的噬菌体衣壳蛋白；而后展示有特异性多肽的噬菌体衣壳蛋白组装于仿酶纳米材料上。

【技术特征摘要】
1.一种检测病原微生物的方法，其特征在于：利用多功能生物纳米探针与待检测靶标病原微生物进行孵育，而后在显色体系下即可实现对其检测；其中，多功能生物纳米探针为利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与病原微生物特异性结合的噬菌体单克隆，再进一步纯化获得离纯化展示有特异性多肽的噬菌体衣壳蛋白；而后展示有特异性多肽的噬菌体衣壳蛋白组装于仿酶纳米材料上。2.按权利要求1所述的检测病原微生物的方法，其特征在于：所述多功能生物纳米探针为，利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与副溶血弧菌特异性结合的噬菌体单克隆，再进一步纯化获得展示有特异性多肽的噬菌体蛋白主要衣壳蛋白pVIII(fusionpVIII)，再将fuisonpVIII组装在蛋白模板法合成的仿酶纳米材料表面从而构建检测副溶血弧菌的多功能生物纳米探针。3.按权利要求1所述的检测病原微生物的方法，其特征在于：所述多功能生物纳米探针的构建首先利用氨基甲酸叔丁酯(BOC)保护fusionpVI...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘爱骅，刘培，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东,37