一种羊无浆体病间接ELISA诊断试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种检测羊无浆体（

A sheep anaplasmosis indirect ELISA diagnostic kit and preparation method thereof

The present invention relates to a sheep free body

【技术实现步骤摘要】
一种羊无浆体病间接ELISA诊断试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及免疫学检测领域，具体为一种羊无浆体病间接ELISA诊断试剂盒及其制备方法。
技术介绍
无浆体是一类由蜱传播的专性胞内寄生菌，主要寄生于牛羊等反刍动物红细胞内，导致无浆体病，旧称边虫病。无浆体与人埃立克体均归类为变形菌纲、立克次氏体目（Rickettsiaies），无浆体科（Anaplasmatacea），无浆体属（Anaplasma），其中羊无浆体（A.ovis）是重要的组成成员，可以引发小反刍动物的无浆体病。该病临床症状为发热、贫血、黄疸、衰弱和渐进性消瘦。血象检测表现为红细胞数量、红细胞压积和血红蛋白含量显著下降，严重感染时可以导致死亡。该病在世界各地广泛流行，在我国许多地区也时有发生，严重阻碍了畜牧业的发展，给畜牧业造成了巨大的经济损失。因此，建立快速、灵敏、准确又操作方便的检测方法十分必要。国内外学者对羊无浆体的检测方法进行了一系列的研究工作，血涂片镜检法、补体结合试验（CF）、卡片凝集试验（CAT）、间接荧光抗体试验（IFAT）、PCR方法等，血涂片镜检法是实际中应用最多的方法。然而该方法需要较强的专业知识来与泰勒虫、巴贝斯虫等血液寄生虫感染进行区别，而且该方法不利于感染早期和感染持续期染虫率极低的情况。虽然补体结合试验（CF）、卡片凝集试验（CAT）、间接荧光抗体试验（IFAT）等也有应用的报道，但补体结合试验操作复杂，不易推广；卡片凝集试验操作简单，但敏感性较差，这些血清学方法鲜有在实践中大量使用的报道，这些方法尚需进一步评价其检测性能。PCR方法虽是一种比较快速灵敏的分子诊断方法，但其需要琼脂糖凝胶电泳分析结果，所需试剂如溴化乙锭，操作稍不慎就对使用者和周围环境产生毒害，而且PCR仪器和凝胶成像系统昂贵，难以在基层单位中推广。至今，世界尚没有用于羊无浆体感染检测的商品化的血清学试剂盒。
技术实现思路
本专利技术提供一种可克服现有技术不足，仅与A.ovis抗体发生反应，而不与其他蜱传病原或相关细菌的抗体发生交叉反应，用于检测A.ovis血清抗体的间接ELISA试剂盒，同时提供制备这一检测试剂盒的方法和试剂盒中所用的A.ovisP35重组抗原，以及这种重组抗原的制备方法。本专利技术的羊无浆体间接ELISA抗体检测试剂盒中包括；已包被抗原、真空包装的酶标板（2块）；标准阳性血清1支（100μl）；标准阴性血清1支（100μl）；50倍HRP标记的兔抗羊抗体1支（100μl）；血清稀释液1瓶（20ml）酶标抗体稀释液1瓶（20ml）；TMB显色液1瓶（20ml）；终止液1瓶（20ml）；50倍浓缩洗涤液1瓶（20ml）。试剂盒4℃保存，保存期为6个月。试剂盒可检测180份血清。本专利技术的羊无浆体间接ELISA抗体检测试剂盒中宝贝酶标板的抗原为重组蛋白，为大肠杆菌表达蛋白，表达的基因位于P35基因的73bp-969bp，经测序，其序列为SEQIDNo.1，长度为897bp，包含P35特异性的抗原表位。该重组抗原的制备方法是：用正向引物SEQIDNo.2，反向引物SEQIDNo.3，以A.ovis全基因组为模板扩增出P35的基因，长度为897bp的片段，将前述扩增片段与pGEM-TEasyVector连接，转化感受态DH5a大肠杆菌，筛选阳性克隆菌株送测序，鉴定正确的重组质粒命名为pGEM-P35。将测序正确的克隆菌株提取重组质粒，再将质粒pET30a和pGEM-P35分别用内切酶EcoRI和HindⅢ双酶切，分别回收目的DNA片段和pET30a载体片段，在连接、转化感受态BL21(DE3)大肠杆菌，筛选阳性克隆菌株，用终浓度1mMol/L的IPTG进行诱导表达，表达产物经纯化后得到重组蛋白,表达后的P35重组蛋白为40KDa。本专利技术的试剂盒中包括；已包被抗原、真空包装的酶标板（2块）；标准阳性血清1支（100μl）；标准阴性血清1支（100μl）；50倍HRP标记的兔抗羊抗体1支（100μl）；血清稀释液1瓶（20ml）酶标抗体稀释液1瓶（20ml）；TMB显色液1瓶（20ml）；终止液1瓶（20ml）;50倍浓缩洗涤液1瓶（20ml）。试剂盒4℃保存，保存期为6个月。试剂盒可检测180份血清。本专利技术经过试验发现，羊无浆体P35基因的部分特异性片段，即P35基因的73-969bp,长度为897bp的片段，只与羊无浆体阳性血清发生反应，而与其它相关病原的阳性血清无交叉反应。经过进一步试验表明，用于这一片段进行检测血清，其结果具有较好的特异性。本专利技术的优越性为：a.选择A.ovis基因的特异性片段进行克隆表达，所选择的基因片段与同属的其它细菌该基因对应片段的同源性低，并且含有P35基因中的特异性抗原表位。因此，这种纯化的重组蛋白作为包被抗原，只与A.ovis阳性血清发生反应，保证了特异性；并且该抗原表位是线性表位，重组蛋白具有良好的反应性，保证了反应的敏感性。b.表达目的基因片段所用的载体是pET-30a，得到的重组蛋白带有组氨酸标签。虽然重组蛋白以包涵体形式存在，但是溶解后可用NIHisTrapFF采用AKTA系统纯化，纯度上保证了与抗体反应的特异性。c.本专利技术涉及的试剂盒应用间接ELISA技术，开放性操作，与目前用于检测羊无浆体的PCR技术跟其它检测血清相比，技术要求比较宽松，具有极大的可操作性。附图说明图1：A.ovisP35基因的PCR扩增。图2：P35重组蛋白的SDS-PAGE分析，其中M：蛋白分子量标准；1：全菌；2：沉淀；3：上清；4纯化产物。图3：P35重组蛋白的Western-blotting分析，其中M:蛋白分子标准；1：抗His标签抗体；2：羊无浆体阳性血清；3阴性血清；4-11：绵羊肺炎支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、羊巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、牛无浆体、牛巴贝斯、环形泰勒虫。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例一、重组抗原制备。根据选定的基因片段设计一对引物，正向引物（SEQIDNo.2）序列为5’-CCGGAATTCAGGGTACTGGTAATGGGC-3’，反向引物（SEQIDNo.3）序列为5’-CCCAAGCTTCTAAATAGCAAGACTTTGCGTATTAG-3’。引物中的下划线为内切酶位点，酶切位点前面3个碱基为保护性碱基，上游引物中酶切为点为EcoRI，下游中酶切位点为HindIII。用全血基因组提取试剂盒，从羊无浆体感染血液中提取全血基因组作为模板，用上述引物通过PCR方法对目的片段进行扩增。扩增得到的目的片段长度为897bp，包含有P35抗原表位。将扩增到的目的片段进行琼脂糖凝胶电泳，纯化、回收目的DNA，将目的DNA片段与pGEM-TEasyVector连接，转化感受态DH5a大肠杆菌，筛选阳性克隆菌株送测序，将测序正确的克隆菌株提取重组质粒，再将质粒pET30a和pGEM-P35分别用内切酶EcoRI和HindⅢ双酶切，分别回收目的DNA片段和pET30a载体片段，在连接、转化感受态BL21(DE3)大肠杆菌，筛选阳性克隆菌株，用终浓度1mMol/L的IPTG进行诱导表达。诱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羊无浆体病间接ELISA诊断试剂盒，包括被抗原包被的酶标板、标准阳性血清、标准阴性血清、HRP标记的兔抗羊抗体、血清稀释液、酶标抗体稀释液、TMB显色液、终止液和浓缩洗涤液，其特征在于所述抗原为重组蛋白P35，核苷酸序列为SEQ No. 1。

【技术特征摘要】
1.一种羊无浆体病间接ELISA诊断试剂盒，包括被抗原包被的酶标板、标准阳性血清、标准阴性血清、HRP标记的兔抗羊抗体、血清稀释液、酶标抗体稀释液、TMB显色液、终止液和浓缩洗涤液，其特征在于所述抗原为重组蛋白P35，核苷酸序列为SEQNo.1。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述重组蛋白P35含有能被羊无浆体阳性血清特异性识别的P35特异抗原表位。3.一种重组蛋白P35的制备方法，其特征在于：正向引物SEQNo.2，反向引物SEQNo.3，以A.ov...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志杰，殷宏，王振国，杨吉飞，牛庆丽，罗建勋，关贵全，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62