一种检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法技术

本发明专利技术涉及一种检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法，属于生物工程领域。本发明专利技术检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法包括如下步骤：包被；洗板；封闭；加核酸适配体和牛血清；洗板；加二抗；显色；终止；读数；阴阳性临界值的确定；Ic‑ELAA方法特异性检测；临床牛血清检测。该方法具有良好的特异性，与商品化ELISA试剂盒相比，Ic‑ELAA具有更高的阳性检出率，更适合进行临床牛副流感疾病的血清学调查。

An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to bovine parainfluenza virus type 3

The invention relates to an indirect competitive enzyme-linked aptamer method for detecting antibodies to bovine parainfluenza virus type 3, which belongs to the field of biological engineering. Indirect competitive enzyme detection of bovine parainfluenza virus type 3 antibody of the invention linked aptamer method comprises the following steps: coating; washing plate; closed; and aptamer and bovine serum; washing plate; two anti; color; termination; reading; and determining critical value; the specific detection of Ic ELAA method; clinical bovine serum. This method has good specificity, compared with commercial ELISA kit, Ic ELAA has higher positive rate, more suitable for clinical serological investigation of bovine influenza disease.

【技术实现步骤摘要】
一种检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法。
技术介绍
牛副流感病毒3型(BPIV-3)是副黏病毒科、呼吸道病毒属的成员，能引起牛和其他反刍动物的呼吸道疾病综合征(BRDC)。牛在运输及处于其他应激环境时容易发生感染，表现出发热和严重的鼻腔分泌物，甚至引发肺炎，是引起舍饲牛发病和死亡的主要原因，给养牛业造成了巨大的经济损失。该病在世界范围内广泛流行，我国多数省份也严重流行。据王海勇对临床千余份牛血清样品的检测结果显示我国牛群BPIV-3抗体总体阳性率为77.6％，说明我国牛群已经普遍感染BPIV。目前尚无治疗BPIV3感染的有效药物。随着集约化饲养模式的迅速发展，牛呼吸道疾病综合征的发病率也在不断升高，控制BPIV-3感染、及时诊断，降低发病率成为目前亟待解决的问题。目前，该病的初步诊断依赖于血清学方法，确诊需要进行病原分离和鉴定。常用的血清学方法主要基于病毒中和试验、荧光抗体试验、血凝抑制试验等。病毒中和试验和荧光抗体试验操作复杂、耗时，不适于大规范样品快速诊断；血凝抑制试验虽然操作简单，但需要在对病毒进行增殖的前提下，以BPIV-3病毒粒子为抗原进行检测，不但耗时而且要求实验室条件较高。因此，寻找快速、灵敏、可靠的诊断方法，对BPIV-3感染的控制及治疗至关重要。核酸适配体可与靶物质以类似抗原-抗体的方式特异性结合，发挥生物学效应，是一种新兴的具有识别功能的分子。适配体与抗体均具有结合靶物质的功能，相比下来适配体具有分子量小、易于合成、筛选简便、修饰多样、亲和力高、稳定性强等优点。适配体的大部分应用也是从抗体应用衍生而来，如光学适配体生物传感器、质量灵敏传感器、电化学适配生传感器、酶联适配体学说、纳米材料传感器等。目前，核酸适配体已广泛应用于化学分析与检测、临床诊断与治疗及药学等研究领域。最近几年来，各种新型适配体检测平台和适配体治疗药物层出不穷。核酸适配体抗肿瘤药物AS1411、具有凝血作用的核酸适配体ARC183、针对金黄色葡萄球菌外毒素B(SEB)的适配体等已经到临床应用阶段。在兽医学研究领域，结果显示以核酸适配体建立的酶联适配体方法具有很高的特异性和敏感性。为了获得优良的牛副流感病毒3型抗体检测方法，我们应用前期研究筛选获得的HN蛋白核酸适配体，优化各步骤反应条件，建立了间接竞争酶联适配体方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法，该方法具有良好的特异性，与商品化ELISA试剂盒相比，Ic-ELAA具有更高的阳性检出率，更适合进行临床牛副流感疾病的血清学调查。本专利技术采用如下技术方案：检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法，包括如下步骤：步骤一，包被：确定HN蛋白包被浓度，吸取HN蛋白溶液包被于ELISA微孔板中，过夜；步骤二，洗板：甩去包被液，用HEPEST洗涤微孔板三次，甩干；步骤三，封闭：确定封闭液，向微孔中加入封闭液，37℃孵育2h；步骤四，加核酸适配体和牛血清：确定核酸适配体Bio-WC-2浓度，并确定牛血清的稀释倍数；甩去封闭液，用HEPEST洗涤三次，甩干，同时将Bio-WC-2和牛血清加入到封闭好的微孔中，孵育；步骤五，洗板：甩去核酸适配体和牛血清，用HEPEST洗涤微孔板三次，甩干；步骤六，加二抗：确定二抗的稀释度，向微孔中加入稀释的HRP-SA，孵育；步骤七，显色：甩去二抗，用HEPEST洗涤微孔板四次，拍干孔中残留的洗涤液，将显色液A、显色液B等体积混合，吸取显色液加入到微孔中，显色；步骤八，终止：每孔加入终止液终止显色；步骤九，读数：使用自动酶标检测仪读取每孔在450nm波长处生物吸光度值(OD)；步骤十，阴阳性临界值的确定；步骤十一，Ic-ELAA方法特异性检测；步骤十二，临床牛血清检测。更进一步地，所述的检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法，包括如下步骤：步骤一，包被：吸取浓度为80ug/mL的HN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃过夜；步骤二，洗板：甩去包被液，用300μLHEPEST洗涤微孔板三次，甩干，其中所述HEPEST为含0.05％Tween20的HEPES；步骤三，封闭：向微孔中加入200μL含1％BSA的HEPES液，37℃孵育2h；步骤四，加核酸适配体和牛血清：确定核酸适配体Bio-WC-2浓度，并确定牛血清的稀释倍数；甩去封闭液，用HEPEST洗涤三次，甩干，同时将50μL浓度为100nM的Bio-WC-2和50μL牛血清原液加入到封闭好的微孔中，37℃孵育1h；步骤五，洗板：甩去核酸适配体和牛血清，用300μLHEPEST洗涤微孔板三次，甩干，其中所述HEPEST为含0.05％Tween20的HEPES；步骤六，加二抗：向微孔中加入100μL1:6000稀释的HRP-SA，37℃孵育1h；步骤七，显色：甩去二抗，用300μLHEPEST洗涤微孔板四次，拍干孔中残留的洗涤液，将显色液A、显色液B等体积混合，吸取100μL显色液加入到微孔中，37℃显色10min；步骤八，终止：每孔加入50μL终止液(2MH2SO4)终止显色；步骤九，读数：使用自动酶标检测仪读取每孔在450nm波长处生物吸光度值(OD)；步骤十，阴阳性临界值的确定；步骤十一，Ic-ELAA方法特异性检测；步骤十二，临床牛血清检测。更进一步地，步骤一中所述HN蛋白包被浓度和步骤四中所述Bio-WC-2浓度的确定具体如下：将不同浓度的HN蛋白(10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL和160ug/mL)与不同适配体Bio-WC-2浓度(200nM、100nM、50nM)建立棋盘方阵进行I-ELAA试验，用酶标仪检测各孔OD450值，通过计算Positive/Negative值来确定HN蛋白包被浓度和核酸适配体Bio-WC-2浓度，确定标准为P/N比值最高且阳性OD450值在1.0左右，实验程序同Ic-ELAA类似，区别是一抗为100μLBio-WC-2，不加牛血清；HN蛋白包被条件为4℃过夜。更进一步地，步骤三中所述封闭液的确定具体如下：将80ug/mL的HN蛋白包被酶标板，4℃包被过夜，洗涤，分别加入不同封闭液5％脱脂奶、10％脱脂奶、1％BSA、3％BSA或10％马血清，进行I-ELAA试验，用酶标仪检测各孔OD450值，通过计算P/N值来确定封闭液。更进一步地，步骤六中所述二抗稀释度的确定具体如下：将80ug/mL的HN蛋白包被酶标板，4℃包被过夜，1％BSA封闭并洗涤，加入100μL浓度为50nM的适配体Bio-WC-2，二抗HRP-SA按1:2000、1:4000、1:6000、1:8000倍比稀释进行I-ELAA试验，用酶标仪检测各孔OD450值，通过计算P/N值来确定封闭液。更进一步地，步骤四中所述牛血清稀释倍数的确定具体为：将80ug/mL的HN蛋白包被酶标板，4℃包被过夜后进行Ic-ELAA试验，血清为已被证实的强阳性和阴性牛血清，分别做1:1、1:2、1:5、1:10倍稀释，加入50μL浓度为100nM的Bio-WC-2和50μL不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，包被：确定HN蛋白包被浓度，吸取HN蛋白溶液包被于ELISA微孔板中，过夜；步骤二，洗板：甩去包被液，用HEPEST洗涤微孔板三次，甩干；步骤三，封闭：确定封闭液，向微孔中加入封闭液，37℃孵育2h；步骤四，加核酸适配体和牛血清：确定核酸适配体Bio‑WC‑2浓度，并确定牛血清的稀释倍数；甩去封闭液，用HEPEST洗涤三次，甩干，同时将Bio‑WC‑2和牛血清加入到封闭好的微孔中，孵育；步骤五，洗板：甩去核酸适配体和牛血清，用HEPEST洗涤微孔板三次，甩干；步骤六，加二抗：确定二抗的稀释度，向微孔中加入稀释的HRP‑SA，孵育；步骤七，显色：甩去二抗，用HEPEST洗涤微孔板四次，拍干孔中残留的洗涤液，将显色液A、显色液B等体积混合，吸取显色液加入到微孔中，显色；步骤八，终止：每孔加入终止液终止显色；步骤九，读数：使用自动酶标检测仪读取每孔在450nm波长处生物吸光度值(OD)；步骤十，阴阳性临界值的确定；步骤十一，Ic‑ELAA方法特异性检测；步骤十二，临床牛血清检测。

【技术特征摘要】
1.检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，包被：确定HN蛋白包被浓度，吸取HN蛋白溶液包被于ELISA微孔板中，过夜；步骤二，洗板：甩去包被液，用HEPEST洗涤微孔板三次，甩干；步骤三，封闭：确定封闭液，向微孔中加入封闭液，37℃孵育2h；步骤四，加核酸适配体和牛血清：确定核酸适配体Bio-WC-2浓度，并确定牛血清的稀释倍数；甩去封闭液，用HEPEST洗涤三次，甩干，同时将Bio-WC-2和牛血清加入到封闭好的微孔中，孵育；步骤五，洗板：甩去核酸适配体和牛血清，用HEPEST洗涤微孔板三次，甩干；步骤六，加二抗：确定二抗的稀释度，向微孔中加入稀释的HRP-SA，孵育；步骤七，显色：甩去二抗，用HEPEST洗涤微孔板四次，拍干孔中残留的洗涤液，将显色液A、显色液B等体积混合，吸取显色液加入到微孔中，显色；步骤八，终止：每孔加入终止液终止显色；步骤九，读数：使用自动酶标检测仪读取每孔在450nm波长处生物吸光度值(OD)；步骤十，阴阳性临界值的确定；步骤十一，Ic-ELAA方法特异性检测；步骤十二，临床牛血清检测。2.根据权利要求1所述的检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，包被：吸取浓度为80ug/mL的HN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃过夜；步骤二，洗板：甩去包被液，用300μLHEPEST洗涤微孔板三次，甩干，其中所述HEPEST为含0.05％Tween20的HEPES；步骤三，封闭：确定封闭液，向微孔中加入200μL含1％BSA的HEPES液，37℃孵育2h；步骤四，加核酸适配体和牛血清：确定核酸适配体Bio-WC-2浓度，并确定牛血清的稀释倍数；甩去封闭液，用HEPEST洗涤三次，甩干，同时将50μL浓度为100nM的Bio-WC-2和50μL牛血清原液加入到封闭好的微孔中，37℃孵育1h；步骤五，洗板：甩去核酸适配体和牛血清，用300μLHEPEST洗涤微孔板三次，甩干，其中所述HEPEST为含0.05％Tween20的HEPES；步骤六，加二抗：确定二抗的稀释度，向微孔中加入100μL1:6000稀释的HRP-SA，37℃孵育1h；步骤七，显色：甩去二抗，用300μLHEPEST洗涤微孔板四次，拍干孔中残留的洗涤液，将显色液A、显色液B等体积混合，吸取100μL显色液加入到微孔中，37℃显色10min；步骤八，终止：每孔加入50μL终止液(2MH2SO4)终止显色；步骤九，读数：使用自动酶标检测仪读取每孔在450nm波长处生物吸光度值(OD)；步骤十，阴阳性临界值的确定；步骤十一，Ic-ELAA方法特异性检测；步骤十二，临床牛血清检测。3.根据权利要求1所述的检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法，其特征在于，步骤一中所述HN蛋白包被浓度和步骤四中所述Bio-WC-2浓度的确定具体如下：将不同浓度的HN蛋白(10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL和160ug/mL)与不同适配体Bio-WC-2浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：王真，王家伟，鲁琳，成杰，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京,11