一种PRRSV、SIV、猪HEV抗体的液相芯片多重检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种猪PRRSV、SIV、HEV抗体的液相芯片多重检测试剂盒；以PRRSV nsp7、SIV HA、HEV ORF2的不同荧光标记微球为载体，在PRRSV、SIV、HEV抗体单一液相芯片检测方法基础上，建立同时检测3种抗体的多重液相芯片检测方法，为HEV、PRRSV、SIV抗体监测提供一种更有效、更快速的检测方法，同时为猪病鉴别诊断及其他动物疫病抗体的血清检测新方法的建立提供新的线索；针对我国养猪业快速发展、猪病情况复杂、混合感染现象严重等养殖现状，进一步加强对猪群疫病情况进行准确、快速、有效的诊断和监测。

Liquid chip multiplex detection kit for pig PRRSV, SIV and HEV antibodies

The present invention provides multiple detection kit of pig PRRSV, SIV, HEV antibody Liquichip; fluorescent microspheres with different PRRSV nsp7, SIV HA, HEV ORF2 as the carrier, based in PRRSV, SIV, HEV antibody single liquid chip detection method, establish the simultaneous detection of multiple solution 3 antibody detection method for PRRSV chip, HEV, and SIV antibody monitoring provides a more effective and more rapid detection methods, and establish a new method for the detection of serum differential diagnosis of swine and other animal disease antibody provides new clues; for the pig industry in our country, the rapid development of pig disease complex, the phenomenon of mixed infection serious breeding situation, further strengthen the diagnosis and monitoring of accurate, rapid and effective on swine epidemic disease situation.

【技术实现步骤摘要】
一种猪PRRSV、SIV、HEV抗体的液相芯片多重检测试剂盒
本专利技术涉及检测
，更具体地，涉及一种猪PRRSV、SIV、HEV抗体的液相芯片多重检测试剂盒。
技术介绍
液相芯片技术也被称为xMAP技术（flexiblemultiple-analyteprofiling），是一种集流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及化学为一体的新型生物分子检测技术，是最早通过美国食品与药物管理局（FDA）认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。目前已经推出第三代检测技术---Flexmap3D，与上一代检测技术相比较，Flexmap3D更加高效，可以同时对一个样本中的500种不同目的分子进行检测，并且可以一次检测384个不同样本，是一种高效检测的方法。猪流感（SwineInfluenza，SI）是猪流感病毒（SwineInfluenzavirus，SIV）引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病，临床上以突发、咳嗽、高热、呼吸困难、精神沉郁、高发病率、低病死率为特征。目前，全球猪群中以经典猪流感H1N1和类人H3N2亚型为主广泛流行，尽管猪流感死亡率低，但是其可造成其他病原的继发感染，对养殖业造成巨大的经济损失。猪是人、禽流感病毒的易感宿主，是流感病毒跨种传播的中间宿主，是流感病毒基因重组的“混合器”，是引起流感大爆发的重要原因。2009年，甲型H1N1流感病毒（pdm2009）在墨西哥、美国相继爆发，该流行毒株是由人流感、猪流感和禽流感病毒基因自然重组而形成的一种新型流感病毒。该毒株的PB1基因来于H3N2人流感，PA和PB2基因来自于北美禽流感，NA和M基因来自欧亚类禽猪流感，HA、NP和NS基因来自经典猪流感。该毒株能通过抗原的变异逃避机体的免疫系统，短时间内迅速蔓延至全球，造成流感的大流行，而引起人们的关注。在猪场内进行定期的SIV抗体监测对于预防其它疾病的出现，以及在人群中流行具有重要的公共卫生学意义。戊型肝炎（HepatitisE，HE）是由戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus，HEV）引起的以黄疸为主要表现的急性病毒性肝炎，主要经粪-口途径传播。该病主要流行于卫生设施不完善的发展中国家（如亚洲和非洲），在发达国家（如美国和一些欧洲国家）也存在散发的情况。戊型肝炎的致死率（1～4%）比甲型肝炎（0.1～2%）的致死率要高，并且对孕妇的致死率能高达30%。HEV具有一个血清型，四个基因型，基因1和2型只感染人，主要流行于亚洲、非洲、墨西哥。基因3、4型宿主范围较广，除了可感染人和家猪外，也可感染鸡、鹿、兔子、老鼠等其他动物。基因3型主要流行于美国、加拿大、阿根廷、西班牙、法国、澳大利亚、荷兰、新西兰等。基因4型分布在中国，日本，印度和越南。因此，戊型肝炎已经是一个重要的公共卫生问题而不只是食物安全和人畜共患病等潜在的风险。猪繁殖与呼吸系统综合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSvirus，PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的高度接触性传染病，主要表现为怀孕母猪后期流产、早产、死胎及木乃伊胎，仔猪发生呼吸系统疾病，并大量死亡。1987年，美国中西部首先爆发该病，并迅速波及其他国家。我国于1996年首次报道该病，并分离到第一株PRRSV。2006年，我国爆发了以高热高死亡为特征的高致病性猪繁殖与呼吸系统综合征（HP-PRRS），其传播迅速、持续时间长，给我国的养殖业带来了巨大的经济素损失，PRRS已经成为危害全球养猪业的重要传染病之一。为减少该病对来损失，对于大型集约化养殖场，针对PRRSV进行血清的抗体监测格外重要。目前主要采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA），由于其敏感度和特异性好，成为许多国家监测和诊断PRRSV的主要方法。尽管如此，ELISA方法无法用于多重诊断；而且当前亟缺一种新的方法，用于对ELISA方法的校对。现有技术中虽然有一些分别针对猪PPRSV、HEV和SIV抗体的检测方法，但其检测较为繁琐，且检测时间长。现有技术缺乏一种能同时检测PPRSV、HEV和SIV三种抗体的检测方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种猪PRRSV、SIV、HEV抗体的液相芯片多重检试剂盒。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：一组用于检测猪戊型肝炎病毒、猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的羧基化荧光微球组，所述羧基化荧光微球组分别由用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的羧基化荧光微球61-Nsp7、用于检测猪流感病毒的羧基化微球46-HA和用于检测猪戊型肝炎病毒的羧基化荧光微球12-ORF2组成；所述羧基化荧光微球61-Nsp7是第61号羧基化荧光微球和PRRSV-nsp7重组蛋白偶联获得；所述羧基化微球46-HA是第46号羧基化荧光微球和SIVHA重组蛋白偶联获得；所述羧基化荧光微球12-ORF2是第12号羧基化荧光微球和HEVORF2重组蛋白偶联获得；其中，SIVHA重组蛋白的制备方法包括以下步骤：S11.去除表达HA基因的信号肽的基因序列，利用HA-F和HA-R引物扩增HA基因；其中，HA-F和HA-R引物的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；S12.连接pMAL-c5X载体，获得pMAL-cHA重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可；其中，HEVORF2重组蛋白的制备方法包括以下步骤：S21.以表达HEVORF2C段第337个到第645个氨基酸片段的核苷酸序列为目的片段，利用上游引物F和下游引物R扩增该目的片段；上游引物F和下游引物R的序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示；S22.连接pMAL-c5X载体，获得pMAL-c5X-ORF2重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可。本专利技术所述检测方法能同时检测SIV、HEV和PPRSV抗体。本研究应用生物学软件SignalPV2.0.b2对HA基因进行信号肽分析，去除HA的信号肽。根据HA序列设计一对带有HIS标签的引物，构建了带有6*His-麦芽糖结合蛋白（MBP）组合标签的原核表达质粒。MBP标签由大肠杆菌K12的malE基因编码，大小约为40KD，在大肠杆菌表达系统中可增加目的蛋白的可溶性；同时，His标签便于重组蛋白的纯化，易于进行之后的实验。前期研究中发现，若去除HA基因的跨膜区，容易影响HA基因表达的抗原的完整性，影响其免疫原性。保留跨膜区也是为了保留HA基因的抗体完整性及其天然构象。使用pMAL-c5X载体的目的是增加目的重组蛋白的可溶性，借以保持其天然空间结构及抗原性。但用于纯化含有MBP标签重组蛋白的Amylose树脂纯化效率较低（即重组蛋白的纯化效率和纯化度低），因此在上述pMAL-c5X重组质粒的基础上，在HA基因下游引入6*His标签基因。其目的是在后期纯化过程中使用Ni2+纯化填料，提高目的蛋白的纯化效率。最终，本研究构建了带有6*His-MBP组合标签的原核表达质粒pMAL-cHA，成功获得以可溶形式表达的HA重组蛋白。该蛋白能够与H1N1亚型猪流感病毒HA鼠源本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于检测猪戊型肝炎病毒、猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的羧基化荧光微球组，其特征在于，所述羧基化荧光微球组分别由用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的羧基化荧光微球61‑Nsp7、用于检测猪流感病毒的羧基化微球46‑HA和用于检测猪戊型肝炎病毒的羧基化荧光微球12‑ORF2组成；所述羧基化荧光微球61‑Nsp7是第61号羧基化荧光微球和PRRSV‑nsp7重组蛋白偶联获得；所述羧基化微球46‑HA是第46号羧基化荧光微球和SIV HA重组蛋白偶联获得；所述羧基化荧光微球12‑ORF2是第12号羧基化荧光微球和HEV ORF2重组蛋白偶联获得；其中，SIV HA重组蛋白的制备方法包括以下步骤：S11. 去除表达HA基因的信号肽的基因序列，利用HA‑F和HA‑R引物扩增HA基因；其中，HA‑F和HA‑R引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；S12. 连接pMAL‑c5X载体，获得pMAL‑cHA重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可；其中，HEV ORF2重组蛋白的制备方法包括以下步骤：S21. 以表达HEV ORF2 C段第337个到第645个氨基酸片段的核苷酸序列为目的片段，利用上游引物F和下游引物R扩增该目的片段；上游引物F和下游引物R的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；S22. 连接pMAL‑c5X载体，获得pMAL‑c5X‑ORF2重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可。...

【技术特征摘要】
1.一组用于检测猪戊型肝炎病毒、猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的羧基化荧光微球组，其特征在于，所述羧基化荧光微球组分别由用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的羧基化荧光微球61-Nsp7、用于检测猪流感病毒的羧基化微球46-HA和用于检测猪戊型肝炎病毒的羧基化荧光微球12-ORF2组成；所述羧基化荧光微球61-Nsp7是第61号羧基化荧光微球和PRRSV-nsp7重组蛋白偶联获得；所述羧基化微球46-HA是第46号羧基化荧光微球和SIVHA重组蛋白偶联获得；所述羧基化荧光微球12-ORF2是第12号羧基化荧光微球和HEVORF2重组蛋白偶联获得；其中，SIVHA重组蛋白的制备方法包括以下步骤：S11.去除表达HA基因的信号肽的基因序列，利用HA-F和HA-R引物扩增HA基因；其中，HA-F和HA-R引物的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；S12.连接pMAL-c5X载体，获得pMAL-cHA重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可；其中，HEVORF2重组蛋白的制备方法包括以下步骤：S21.以表达HEVORF2C段第337个到第645个氨基酸片段的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：王衡，张桂红，纪方晓，冀池海，曾梦，陈万里，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44