一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片及其检测方法，该芯片设有多个水相腔和油相腔，该水相腔和油相腔交替排列为一行，且前后的腔体互相连通，水相腔设有水相进口，油相腔设有油相进口，最左边的水相腔和一染料腔连接，该染料腔另设有第三进口；染料腔和一染料气柱通道连通，染料气柱通道旁设有刻度。本发明专利技术将繁琐的免疫实验步骤、清洗步骤、距离信号输出集成到一块微流控气动芯片上，可用于对蛋白、细胞等多种靶标的高灵敏定量即时检测。

Integrated ELISA chip based on range detection target and detection method thereof

The invention discloses an integrated ELISA chip distance target detection and detection method based on the chip is provided with a plurality of water phase and oil phase cavity cavity, the water chamber and the oil phase cavity are arranged alternately in a line, and the cavity and connected with each other, the aqueous chamber is provided with a water inlet, the oil cavity is provided with an oil inlet the left side of the cavity, and a water chamber is connected with the dye, dye cavity with third other dyes and dyes imported; cavity gas column channel communicated, gas channel is arranged beside the dye scale. The invention integrates the complicated immunological experiment steps, cleaning steps and distance signal output to a micro fluidic pneumatic chip, and can be used for the high sensitivity and quantitative immediate detection of a plurality of targets such as proteins, cells, etc..

【技术实现步骤摘要】
一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片及其检测方法本专利技术涉及一种将繁琐的免疫实验步骤、清洗步骤、信号输出集成到一块微流控气动芯片上的集成检测方法，用于对蛋白、细胞等多种靶标的高灵敏定量即时检测。
技术介绍
酶联免疫吸附反应(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA)最早在1971年由Engvall和Perlmann提出。它是一种将已知抗体或抗原吸附在固相载体(如聚苯乙烯板、微孔滤膜、磁珠等)表面并保持其免疫原性，利用酶标抗原抗体间的特异性反应进行标记，根据酶催化底物显色深浅程度进行定性或定量检测的技术。该方法具有适用范围广、灵敏度高、特异性强、操作规范及易于自动化等优点，在食品安全检测、水污染防治和临床疾病诊断等领域成为备受重视并广泛应用的检测分析方法。目前，基于免疫反应的临床诊断等主要依赖于光学、电学、磁学等分析方法。然而这些检测手段一般均需大型仪器和专业操作人员，操作复杂，耗时久，且费用昂贵。为了克服这些局限性，发展新型的信号转导、简单输出方法是目前科学家们的研究热点，例如研究者们已发展了以血糖仪、时间、气味等作为信号输出方法的便携式传感器，用于快速、原位、低成本检测，然而这些方法仍然存在操作复杂、灵敏度低等、集成化程度低等问题(1.Y.J.Song,Y.Q.Zhang,P.E.Bernard,J.M.Reuben,N.T.Ueno,R.B.Arlinghaus,Y.L.Zu,L.D.Qin,Nat.Commun.2012,3,1283.；2.H.Noh,S.T.Phillips,Anal.Chem.2010,82,8071–8078.；4.H.Mohapatra,S.T.Phillips,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,11145–11148；Angew.Chem.2012,124,11307–11310.)。因此，发展更为高灵敏、高选择性、简单、廉价、集成化程度高的新型即时检测技术，用于生物医学分析，尤其是特定疾病的生物标志物的定量检测，成为目前生物医学亟待解决的问题。建立ELSIA作为一个快速、廉价以及集成化的检测方法用于POCT的检测，研究者们做出了很多尝试。Vashist等尝试用一步法ELSIA降低整个实验的时间，但其整个操作过程仍然需要专业操作，以及专门的信号读出仪器(5.S.K.Vashist,E.M.Schneider,E.Lam,S.HrapovicandJ.H.T.Luong,ScientificReports,2014,4,7.)。Yeh等将三明治ELSIA集成到一块芯片上，即使用智能手机可以将信号读出方式，但其仍然需要将样品用枪头析出然后再进行检测，不算真正意义的集成(6.Y.-T.Yeh,M.Nisic,X.Yu,Y.XiaandS.-Y.Zheng,AnnalsofBiomedicalEngineering,2014,42,2333-2343.)。Dai-WenPang等人用纸芯片实现了CRP蛋白的检测，而荧光作为信号也限制了其在POCT领域的应用(7.JiaoHu,Zhi-LingZhang,Cong-YingWen,ManTang,Ling-LingWu,CuiLiu,LianZhu,andDai-WenPang.Anal.Chem.,2016,88(12),pp6577–6584)。所以尽管POC检测目前研究者们已经做出来大量尝试，然而建立一种真正集成化、便携、快速廉价、高灵敏的检测方法迫在眉睫。综上所述，在未来的科学研究中，如何发展一种高灵敏、高选择性、简单、廉价、集成化程度高的新型即时检测技术，用于生物医学分析，尤其是特定疾病的生物标志物的定量检测，可应用于即时诊断的的定量检测分析方法是亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术针对现有高灵敏定量检测分析方法及其仪器设备价格昂贵、实验方法成本高、免疫反应操作复杂、耗时等缺点，发展了一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片方法。该方法采用分子识别引入信号放大分子如酶或纳米粒子，通过信号放大分子或粒子催化底物释放出大量气体分子，实现信号放大，因而可以用于实验室中高灵敏度、高选择性的无机离子、小分子、生物大分子例如蛋白质、DNA、甚至病毒、细菌、细胞等多种靶标的高灵敏度定量。另外，将繁琐的免疫反应以及距离信号输出集成在一起，所有实验方法均在芯片内完成，不需任何外接仪器的即时检测系统，能用于集成化地、高灵敏度POC定量检测分析。本专利技术的技术方案如下：一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片，其设有多个水相腔和油相腔，该水相腔和油相腔交替排列为一行，且前后的腔体互相连通，水相腔设有水相进口，油相腔设有油相进口，行末的水相腔和一染料腔连接，该染料腔另设有第三进口；染料腔和一染料气柱通道连通，染料气柱通道旁设有刻度。在较佳的实施例中，水相腔的数量和油相腔的数量分别为5-15个。在较佳的实施例中，水相腔中至少包括过氧化氢溶液，PtNPs溶液，链霉亲和素溶液和生物素化抗体溶液，每种溶液独立设于一水相腔内。在较佳的实施例中，油相腔中含有矿物油。在酶联免疫吸附法体系中，基于距离检测靶标的定量检测方法包括如下步骤：(1)根据要检测的抗原选择相对应的捕获抗体及检测抗体；(2)对信号放大分子进行修饰，使其与检测抗体分子偶联结合，或使其能够特异性的与检测抗体结合；(3)在磁珠或微球表面进行包被，加入捕获抗体使其结合于包被后的固相表面，之后进行封闭液封闭。(4)将以下试剂载入芯片：检测抗原与捕获抗体包被的磁珠，检测抗体、信号放大分子，洗去多余试剂的洗涤缓冲液，底物以及染料，其中；水相从水相进口进入水相腔；油相从油相进口进入各油相腔，染料加入染料腔，磁珠和样品加入第一个水相腔；(5)密封加样孔，磁移动，利用磁铁对磁珠拉动，将磁珠和样品从第一个水相腔拉至最后一个水相腔，完成每一步反应，信号放大分子催化底物分子，生成大量气体分子，气体推动染料前进产生距离信号；(6)根据距离信号，记录数据，进而建立标准曲线，实现未知样品中靶标分子的定量检测。本专利技术一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片方法，将繁琐的免疫实验步骤、清洗步骤、距离信号输出集成到一块微流控气动芯片上，利用分子识别引入信号放大分子或粒子，通过信号放大分子或粒子催化底物释放出气体分子，导致气体推动染料前进，并最终通过读取染料移动的距离，实现高灵敏定量集成化检测。其中，所述的集成，是将繁琐的免疫反应以及距离信号输出集成在一起，所有实验方法均在芯片内完成，组成一个不需任何外接仪器的即时检测系统。其中，基于距离的可视化定量方法是将不同浓度的待测物作为信号输入，经过特定的反应后以不同长度的有色条带作为输出信号。用户只需要通过读取条带的长度,即可实现对待测物的可视化定量检测。其中，所述的分子识别包括，利用具有特异性识别功能的分子对所述靶标进行识别或标记，并通过将该识别分子将信号放大分子或粒子引入检测体系中。其中，所述信号放大分子包括能够催化底物产生气体的催化剂或酶，其催化底物为受催化后产生气体分子的物质，气体分子为底物受催化后的产物。其中，所述的信号放大分子包括过氧化氢酶、金纳米粒子、铂纳米粒子、金铂纳米粒子、锰氧化物纳米粒子或其他可以催本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于距离检测靶标的集成化ELSIA芯片，其特征在于，其设有多个水相腔和油相腔，该水相腔和油相腔交替排列为一行，且前后的腔体互相连通，水相腔设有水相进口，油相腔设有油相进口，行末的水相腔和一染料腔连接，该染料腔另设有第三进口；染料腔和一染料气柱通道连通，染料气柱通道旁设有刻度。

【技术特征摘要】
1.一种基于距离检测靶标的集成化ELSIA芯片，其特征在于，其设有多个水相腔和油相腔，该水相腔和油相腔交替排列为一行，且前后的腔体互相连通，水相腔设有水相进口，油相腔设有油相进口，行末的水相腔和一染料腔连接，该染料腔另设有第三进口；染料腔和一染料气柱通道连通，染料气柱通道旁设有刻度。2.一种基于距离检测靶标的集成化ELSIA芯片，其特征在于，水相腔的数量和油相腔的数量分别为5-15个。3.一种基于距离检测靶标的集成化ELSIA芯片，其特征在于，水相腔中至少包括过氧化氢溶液，PtNPs溶液，链霉亲和素溶液和生物素化抗体溶液，每种溶液独立设于一水相腔内。4.一种基于距离检测靶标的集成化ELSIA芯片，其特征在于，油相腔中含有矿物油。5.如权利要求1所述的一种基于距离检测靶标的集成化ELSIA芯片，其特征在于，该芯片包括上层(1)、中层(2)和下层(3)，其中，中层(2)中间设有一行由圆形孔和椭圆形孔交替设置的腔，其中圆形孔为水相腔(21)，椭圆形孔为油相腔(22)，且相邻的孔互相连通；在最左侧的圆形孔侧面设有染料腔(23)，该最左侧的圆形孔和染料腔(23)连通；该中层设有S形弯折排列的染料气柱通道(24)，染料气柱通道(24)的侧面设刻度(25)；染料气柱通道(24)的起点和染料腔(23)连通，终点为出气孔(26)；中层的右上角设多个水相通孔(27)；上层左上角设有多个水相进样孔(12)，该每个水相进样孔(12)分别和一水相槽(11)连接，每条油相槽(11)设于上层的下表面，起点位于水相进样孔(12)，终点位于中层圆形水相腔(21)的对应位置；上层的右上角设有多个油相进样孔(17)，其位置和数量分别和中层右上角的油相通孔(27)的位置和数量对应；下层上表面设有多道油相槽(37)，每个油相槽(37)起点分别为中层的油相通孔(27)对应的位置，终点为中层的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝勇，刘丹，周君恺，李星锐，李久兴，朱志，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35