棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记方法技术

本发明专利技术提供了一种棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记方法，包括以下工艺步骤：固定液固定、脱水、冷冻切片、非特异性荧光的去除、免疫标记及封片等步骤，本发明专利技术是在将荧光素与棉花幼嫩部位的微管骨架相结合，对棉花幼嫩组织微管骨架进行免疫标记，从组织水平上观察幼嫩组织微管骨架的变化，对棉花对非生物逆境胁迫的抗性以及棉花对病虫害的抗性进行研究。本发明专利技术步骤简单，易于掌握，结果清晰，适合对棉花幼嫩组织微管骨架进行观察。对其他植物幼嫩组织微管骨架观察也有一定的参考价值。

Immunofluorescent antibody marking method of cotton young tissue microtubule skeleton

The present invention provides a fluorescent antibody labeling method for cotton young tissue microtubule, the process comprises the following steps: fixation, dehydration, freezing, nonspecific fluorescence removal, immunoassay and mounting steps, the invention is in the microtubule cytoskeleton of fluorescein and cotton young organs combined immunization mark on the cotton young tissues to observe the changes of microtubule and microtubule organization from young tissue level, to study the resistance of cotton resistance to abiotic stress and plant diseases and insect pests on cotton. The method has simple steps, is easy to master, and has clear results, and is suitable for observing the microtubule skeleton of cotton young tissue. It also has some reference value for observation of microtubule skeleton in other plants.

【技术实现步骤摘要】
棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记方法
：本专利技术属于棉花科学研究
，具体涉及一种棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记方法。
技术介绍
：棉花是我国重要的经济作物之一，低温、干旱和盐害等一些非生物胁迫严重影响棉花的生长和发育，同时病虫害也是影响棉花生长和发育的重要原因之一，因此，棉花对非生物逆境胁迫的抗性以及棉花对病虫害的抗性是目前科研人员对棉花进行科学研究的重要内容。荧光抗体标记技术是将荧光素以化学方法与特异性抗体共价结合，形成荧光素-蛋白质结合物，即荧光标记抗体，此结合物仍保留着抗体活性，同时具有荧光素的失踪作用，当它与相应的抗原特异结合后，借助于荧光显微镜观察呈现明亮的特异荧光。在对棉花对非生物逆境胁迫的抗性以及棉花对病虫害的抗性进行研究时，通常采用荧光抗体标记技术。目前，在对棉花采用荧光抗体标记技术进行研究时，主要是将荧光抗体标记技术标记在棉花的花粉粒、原生质体、以及通过酶解解离出的单个植物根尖细胞。但是，目前还没有将荧光抗体标记在棉花的组织水平上，如棉花的茎尖部位微管骨架、根尖部位的微管骨架。而微管是细胞骨架的重要组成成分。微管骨架以及附属的微管结合蛋白广泛参与细胞形态的维持、细胞伸长与分裂、物质运输、细胞分化等生命活动。同时也可作为信号基体，参与植物生长发育、植病互作、植物与逆境胁迫等。
技术实现思路
：综上所述，为了克服现有技术问题的不足，本专利技术提供了一种棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记方法，它是在将荧光素与棉花幼嫩部位的微管骨架相结合，对棉花幼嫩组织微管骨架进行免疫标记，从组织水平上观察幼嫩组织微管骨架的变化，对棉花对非生物逆境胁迫的抗性以及棉花对病虫害的抗性进行研究。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记方法，其中：包括以下工艺步骤：第一步、固定液固定切取棉花幼嫩组织，将该幼嫩组织放入装有固定液的密封容器内，将密封容器抽真空8~15分钟，然后将密封容器在25~30℃温度下静置1.5~3小时，密封容器内的固定液将棉花幼嫩组织固定；第二步、脱水将密封容器内的棉花幼嫩组织取出，然后将该幼嫩组织放入蔗糖磷酸缓冲液中浸泡脱水；第三步、冷冻切片将脱水后的棉花幼嫩组织放入冷冻切片机内切片，冷冻切片机内部温度为-25~-35℃，切片厚度18~25微米，第四步、非特异性荧光的去除将切片放入甘氨酸溶液中浸泡30-40分钟，再用PBS缓冲液冲洗1~2次,每次5min，冲洗温度28-30度；第五步、免疫标记a、将切片放入抗α-tubulin的一抗工作液中，在32℃温度下一次孵育2小时；b、将一次孵育后的切片用漂洗液反复漂洗三次，每次至少8分钟；c、将漂洗后的切片放入FITC标记的二抗工作液中，在黑暗环境及37℃的温度下二次孵育2小时；d、将二次孵育后的切片用漂洗液反复漂洗三次，每次至少8分钟；第六步、封片利用PBS-甘油溶液将免疫标记后的切片封片，至此完成棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记。本专利技术的技术方案还可以是这样实现的：第一步、固定液固定中，所述的固定液为含有质量百分比为0.4%的戊二醛、质量百分比为3.6%的多聚甲醛、质量百分比为0.02%的Triton-100、pipes、MEGTA及MgSO4，其中pipes的摩尔浓度为50mM，MEGTA的摩尔浓度为5mM，MgSO4的摩尔浓度为5mM。本专利技术的技术方案还可以是这样实现的：第一步、固定液固定中，所述的棉花幼嫩组织指棉花茎尖以下1厘米的组织，或为棉花根尖以上1厘米的组织，切取的棉花幼嫩组织的长度小于等于3里面，厚度小于等于1厘米。本专利技术的技术方案还可以是这样实现的：第二步、脱水时，先将固定液固定后的棉花幼嫩组织放入质量体积比为0.5%的蔗糖-磷酸缓冲液中浸泡1~3小时，再放入质量体积比为1.5%的蔗糖-磷酸缓冲液中浸泡1~3小时，然后放入质量体积比为3%的蔗糖-磷酸缓冲液中浸泡1~3小时，最后放入质量体积比为4%的蔗糖-磷酸缓冲液中浸泡1~3小时。本专利技术的技术方案还可以是这样实现的：第二步、脱水时，所述的蔗糖-磷酸缓冲液的PH值为7.1~7.5。本专利技术的技术方案还可以是这样实现的：第三步、冷冻切片时，先将脱水后的棉花幼嫩组织浸没在OCT包埋剂中8~10分钟，然后将棉花幼嫩组织放入冷冻切片机内在-25~-35℃温度下冷冻10~15分钟，最后再将其固定切片。本专利技术的技术方案还可以是这样实现的：第四步、非特异性荧光的去除中，所述的甘氨酸溶液得摩尔浓度为80mM，所述的PBS缓冲液的PH值为7.3。本专利技术的技术方案还可以是这样实现的：第五步、免疫标记中，所述的一抗工作液及二抗工作液中均含有1％牛血清蛋白，所述的一抗工作液为经PBS溶液稀释200倍的anti-αtubulin抗体溶液稀释液，所述的二抗工作液为经PBS溶液稀释100倍的FITC标记的anti-αtubulin抗体溶液稀释液。本专利技术的技术方案还可以是这样实现的：第五步、免疫标记中，所述的漂洗液为PBS缓冲液。本专利技术的技术方案还可以是这样实现的：第六步、封片中，所述的PBS-甘油溶液中PBS与甘油的体积比为1:1，PBS-甘油溶液中含有间苯二胺，间苯二胺与PBS-甘油溶液的质量体积比为0.1：100，所述的PBS-甘油溶液的PH值为8.5~9.0。本专利技术的有益效果为：1、本专利技术是在将荧光素与棉花幼嫩部位的微管骨架相结合，对棉花幼嫩组织微管骨架进行免疫标记，从组织水平上观察幼嫩组织微管骨架的变化，对棉花对非生物逆境胁迫的抗性以及棉花对病虫害的抗性进行研究。2、本专利技术对固定液固定后的棉花幼嫩组织通过0.5%、1.5%、3%、4%的蔗糖磷酸缓冲液进行梯度脱水，棉花幼嫩组织含水量较大，冰冻切片，随着切片温度逐渐与室温平衡，细胞内的水分液化膨胀，容易将组织细胞涨破，导致在组织切片图上留下许多孔状的空隙，导致细胞结构的损伤，甚至微管结构的移位,影响实验结果的准确性。因此，需要对棉花幼嫩组织进行梯度脱水步骤，能够有效缓解这种现象。3、本专利技术采用蔗糖磷酸缓冲液对棉花幼嫩组织进行脱水后，进行冷冻切片，此时，组织表面有蔗糖残留，冷冻时，蔗糖作为冷冻保护剂，蔗糖能与组织细胞中的水分结合，降低细胞内溶液的冰点,减少冰晶或较大冰晶的形成，从而减轻细胞损伤，冰冻切片技术的采用，不仅仅使实验变得快速、简便、易操作，而且缩短了常规石蜡切片缓慢而复杂的处理过程，减少对样品组织活性物质的损伤，更好地保存生物分子活性，同时在一定程度上破坏了细胞壁，在冷冻条件下，利用机械力打开细胞壁，同时细胞的形态不会发生改变，利于微管抗体进入细胞与微管结合。4、本专利技术的第四步消除了部分非特异性荧光，通过较高浓度的甘氨酸处理，避免了固定液中的残留的醛类物质的自发荧光对实验结果的干扰，使得荧光信号更强，背景信号更弱，微管骨架更清晰。5、本专利技术步骤简单，易于掌握，结果清晰，实际应用价值高。为棉花细胞生物学研究开辟了崭新的方向，同时也可以弥补棉花分子生物学研究的缺陷，本专利技术不仅适用于棉花幼嫩部位，对其他植物幼嫩部位微管骨架观察也有一定的参考价值。附图说明图1为棉花三叶期茎尖以下1厘米处主茎外皮层细胞微管骨架观察结果；图2为棉花三叶期根尖以上1厘米处根部外皮层细胞微管骨架观察结果；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：第一步、固定液固定切取棉花幼嫩组织，将该幼嫩组织放入装有固定液的密封容器内，将密封容器抽真空10~15分钟，然后将密封容器在25~30℃温度下静置1.5~3小时，密封容器内的固定液将棉花幼嫩组织固定；第二步、脱水将密封容器内的棉花幼嫩组织取出，然后将该幼嫩组织放入蔗糖磷酸缓冲液中浸泡脱水；第三步、冷冻切片将脱水后的棉花幼嫩组织放入冷冻切片机内切片，冷冻切片机内部温度为‑25~‑35℃，切片厚度18~25微米，第四步、非特异性荧光的去除将切片放入甘氨酸溶液中浸泡30‑40分钟，再用PBS缓冲液冲洗1~2次, 每次5min，冲洗温度28‑30度；第五步、免疫标记a、将切片放入抗α‑tubulin的一抗工作液中，在32℃温度下一次孵育2小时；b、将一次孵育后的切片用漂洗液反复漂洗三次，每次至少8分钟；c、将漂洗后的切片放入FITC标记的二抗工作液中，在黑暗环境及37℃的温度下二次孵育2小时；d、将二次孵育后的切片用漂洗液反复漂洗三次，每次至少8分钟；第六步、封片利用PBS ‑甘油溶液将免疫标记后的切片封片，至此完成棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记。...

【技术特征摘要】
1.一种棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：第一步、固定液固定切取棉花幼嫩组织，将该幼嫩组织放入装有固定液的密封容器内，将密封容器抽真空10~15分钟，然后将密封容器在25~30℃温度下静置1.5~3小时，密封容器内的固定液将棉花幼嫩组织固定；第二步、脱水将密封容器内的棉花幼嫩组织取出，然后将该幼嫩组织放入蔗糖磷酸缓冲液中浸泡脱水；第三步、冷冻切片将脱水后的棉花幼嫩组织放入冷冻切片机内切片，冷冻切片机内部温度为-25~-35℃，切片厚度18~25微米，第四步、非特异性荧光的去除将切片放入甘氨酸溶液中浸泡30-40分钟，再用PBS缓冲液冲洗1~2次,每次5min，冲洗温度28-30度；第五步、免疫标记a、将切片放入抗α-tubulin的一抗工作液中，在32℃温度下一次孵育2小时；b、将一次孵育后的切片用漂洗液反复漂洗三次，每次至少8分钟；c、将漂洗后的切片放入FITC标记的二抗工作液中，在黑暗环境及37℃的温度下二次孵育2小时；d、将二次孵育后的切片用漂洗液反复漂洗三次，每次至少8分钟；第六步、封片利用PBS-甘油溶液将免疫标记后的切片封片，至此完成棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记。2.根据权利要求1所述的棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记方法，其特征在于：第一步、固定液固定中，所述的固定液为含有质量百分比为0.4%的戊二醛、质量百分比为3.6%的多聚甲醛、质量百分比为0.02%的Triton-100、pipes、MEGTA及MgSO4，其中pipes的摩尔浓度为50mM，MEGTA的摩尔浓度为5mM，MgSO4的摩尔浓度为5mM。3.根据权利要求1所述的棉花幼嫩组织微管骨架的免疫荧光抗体标记方法，其特征在于：第一步、固定液固定中，所述的棉花幼嫩组织指棉花茎尖以下1厘米的组织，或为棉花根尖以上1厘米的组织，切取的棉花幼嫩组织的长度小于等于3里面，厚度小于等于1厘米。4.根据权利要求1所述的棉花幼嫩组...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵付安，李艺，李武，房卫平，侯甲男，
申请(专利权)人：河南省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41