一种测定自由巯基含量的方法技术

本发明专利技术提供一种测定自由巯基含量的方法，所述方法包括以下步骤：将供试品溶液进样至高效液相色谱仪中进行色谱分离，而后经过衍生仪时在衍生试剂的作用下进行衍生，由紫外检测器采集液相色谱数据；利用已知自由巯基浓度的对照品溶液作为对照；通过供试品溶液的液相色谱峰面积与已知自由巯基浓度的对照品溶液的液相色谱峰面积的比较，计算得到供试品中自由巯基的含量。本发明专利技术的方法具有专属性好，灵敏度高的特点，可以最大限度地免受其他物质信号的干扰，测定结果准确度高，数据可靠。

Method for determining free sulfhydryl content

The present invention provides a method for the determination of free sulfhydryl content, the method comprises the following steps: for chromatographic separation of sample solution into the sample to high performance liquid chromatography, and then through the derivative instrument in the derivatization reagent under the action of derivatives, by UV detector liquid chromatography data acquisition; as compared with the control the solution of known concentration of free sulfhydryl groups; comparison of peak area of referencesolution peak area and the concentration of free sulfhydryl groups known by the testsolution liquid chromatography liquid chromatography, calculated the tested content of free sulfhydryl products. The method of the invention has the advantages of good specificity and high sensitivity, and the interference of other substance signals can be avoided to the maximum extent, the accuracy of the measurement result is high, and the data is reliable.

【技术实现步骤摘要】
一种测定自由巯基含量的方法
本专利技术属于化学分析
，涉及一种测定自由巯基含量的方法。
技术介绍
自由巯基含量的测定方法有毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用法等，也可采用紫外-可见光谱法或者荧光光谱法。然而，毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用法，紫外光谱法的灵敏度和准确度比较低，但是这种方法简单、快速，并且反应条件温和，且可以同时测定总的自由巯基而被大家广泛采用。其中Ellman试剂应用最为广泛，中国药典里面收载的蛋白质中自由巯基的含量测定方法即采用该法。但当该方法测定自由巯基的残留时，即测定某种物质中自由巯基的痕量时，该方法就存在灵敏度太低的问题。而在某些反应中，尤其该物质作为起始物料或中间物质时，由于多余自由巯基物质，如二巯基聚乙二醇，二硫苏糖醇等，需要严格控制其残留。CN102759586A公开了高效液相色谱法测定组合物中巯基化合物含量的方法，在该方法中利用甲酸作为巯基化合物的稳定剂，流动相为含有甲酸的水相与有机相的混合物，可以明显解决或减缓巯基化合物在供试液和流动相中因极端不稳定现象而造成的含量测定误差，然而其并不能提高检测的灵敏度，并不能准确检测残留的痕量自由巯基的含量。因此，在本领域，急需开发一种高灵敏度，且专属性好的方法来测定样品中的自由巯基含量。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种测定自由巯基含量的方法，本专利技术方法具有专属性好，灵敏度高的特点，可以最大限度地免受其他物质信号的干扰，测定结果准确度高，数据可靠。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种测定自由巯基含量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将供试品溶液进样至高效液相色谱仪中进行色谱分离，经过衍生仪时在衍生试剂的作用下进行衍生，由紫外检测器采集液相色谱数据；(2)利用已知自由巯基浓度的对照品溶液经过与步骤(1)所述供试品溶液相同的处理，得到对照品溶液的液相色谱数据；(3)通过供试品溶液的液相色谱峰面积与对照品溶液的液相色谱峰面积的比较，计算得到供试品中自由巯基的含量。在本专利技术中，通过利用高效液相色谱法并使用衍生剂使得可以大大提高检测的灵敏度，以解决目前测定自由巯基方法中存在的其它物质干扰大，灵敏度差的问题。优选地，步骤(1)所述供试品为需要测定自由巯基含量的样品。优选地，所述含有自由巯基的物质为二巯基聚乙二醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸或2-巯基乙醇中的任意一种或至少两种的混合物。在本专利技术中，所述含有自由巯基的物质不限于如上列举的具体物质，其他含有自由巯基的化合物或混合物均可以利用本专利技术的方法实现精确的测定。利用本专利技术所述的方法可以完成样品中残留自由巯基的检测，例如本专利技术可以实现交联玻璃酸钠中二巯基聚乙二醇的残留的定量检测。在本专利技术中，所述色谱分离时的流动相可以为一切可以溶解供试品并通过HPLC进行测定的溶剂或溶剂混合物。优选地，步骤(1)所述色谱分离时的流动相为醇类、乙腈或水中的任意一种或至少两种的混合物。优选地，步骤(1)所述色谱分离时的流动相为5％～95％(例如5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)乙腈，优选60-80％的乙腈。优选地，步骤(1)所述色谱分离时使用的色谱柱为含有长链烷基键合相的色谱柱或其相关色谱柱，优选C18柱；柱温为4～50℃(例如4℃、8℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃)，优选30～50℃。优选地，步骤(1)所述色谱分离时样品流速为0.1～5mL/min，例如0.1mL/min、0.3mL/min、0.5mL/min、0.8mL/min、1mL/min、1.3mL/min、1.5mL/min、1.8mL/min、2mL/min、2.5mL/min、2.8mL/min、3mL/min、3.5mL/min、4mL/min、4.5mL/min或5mL/min。优选地，步骤(1)所述衍生剂为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DNTB)的磷酸钠-EDTA(乙二胺四乙酸)缓冲液。优选地，所述衍生剂中5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的浓度为0.01～100mg/100mL，例如0.01mg/100mL、0.05mg/100mL、1mg/100mL、3mg/100mL、5mg/100mL、8mg/100mL、10mg/100mL、15mg/100mL、20mg/100mL、30mg/100mL、40mg/100mL、50mg/100mL、60mg/100mL、70mg/100mL、80mg/100mL、90mg/100mL或100mg/100mL，优选0.05～20mg/100mL。在本专利技术中，如果衍生剂中5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的浓度过低则衍生不够完全，如果浓度过高，则干扰较大，均会影响到结果的准确性。优选地，所述衍生剂中磷酸钠的浓度为0.01～1mol/L，例如0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.05mol/L、0.07mol/L、0.09mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L或1mol/L，优选0.05～0.5mol/L。在本专利技术中，磷酸钠的浓度太低则缓冲效果差，在测定自由巯基含量较高的样品时影响衍生效果，浓度太高，则会由于缓冲液中离子浓度过高，从而影响衍生后数据采集时基线的平稳，影响检测方法的灵敏度。优选地，所述衍生剂中磷酸钠缓冲液的pH值为6～12，例如6、6.3、6.5、6.8、7、7.3、7.5、7.8、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5或12，优选7～10。优选地，所述衍生仪的衍生管的长度为0.2～50m，例如0.2m、0.5m、1m、3m、5m、8m、10m、15m、20m、25m、30m、35m、40m、45m或50m。衍生管长度太短会导致样品通过衍生管时时间太短，衍生不完全，导致检测结果比真实值偏低；衍生管长度太长，衍生完成的样品通过衍生管的时间就会比较长，扩散效应明显，从而导致数据采集时色谱峰不明显，影响检测的灵敏度。优选地，所述衍生仪的衍生温度为20～100℃，例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃。优选地，所述衍生仪中衍生试剂的流速为0.1～5mL/min，例如0.1mL/min、0.3mL/min、0.5mL/min、0.8mL/min、1mL/min、1.3mL/min、1.5mL/min、1.8mL/min、2mL/min、2.5mL/min、2.8mL/min、3mL/min、3.5mL/min、4mL/min、4.5mL/min或5mL/min。优选地，所述紫外检测器采集液相色谱数据为采集检测波长为380～450nm的数据。相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的方法对于样品中自由巯基含量的测定具有专属性好，灵敏度高的特点，可以最大限度地免受其他物质信号的干扰，该方法检测限为1μg/mL，定量限为4μg/mL，准确度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定供试品中自由巯基的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将供试品溶液进样至高效液相色谱仪中进行色谱分离，经过衍生仪时在衍生试剂的作用下进行衍生，由紫外检测器采集液相色谱数据；(2)利用已知自由巯基浓度的对照品溶液经过与步骤(1)所述供试品溶液相同的处理，得到对照品溶液的液相色谱数据；(3)通过供试品溶液的液相色谱峰面积与对照品溶液的液相色谱峰面积的比较，计算得到供试品中自由巯基的含量。

【技术特征摘要】
1.一种测定供试品中自由巯基的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将供试品溶液进样至高效液相色谱仪中进行色谱分离，经过衍生仪时在衍生试剂的作用下进行衍生，由紫外检测器采集液相色谱数据；(2)利用已知自由巯基浓度的对照品溶液经过与步骤(1)所述供试品溶液相同的处理，得到对照品溶液的液相色谱数据；(3)通过供试品溶液的液相色谱峰面积与对照品溶液的液相色谱峰面积的比较，计算得到供试品中自由巯基的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述供试品为含有自由巯基的物质的样品。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含有自由巯基的物质为二巯基聚乙二醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸或2-巯基乙醇中的任意一种或至少两种的混合物。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述色谱分离时的流动相为醇类、乙腈或水中的任意一种或至少两种的混合物；优选地，步骤(1)所述色谱分离时的流动相为5％～95％乙腈，优选60-80％乙腈。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述色谱分离时使用的色谱柱为含有长链烷基键合相...

【专利技术属性】
技术研发人员：张兆利，郑琳松，刘珊，
申请(专利权)人：上海景峰制药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31