一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法技术

本发明专利技术公开了一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法，属于检验检疫领域。本发明专利技术方法是将实蝇幼虫沿着背侧线从头部或腹末肛门处将整个虫体剪开，去除虫体内含物，漂洗干净，添加适量有机溶剂，快速充分的研磨提取1‑4 min，然后再加入等量的有机溶剂，浸提1‑5 min，收集所有浸提液；过柱分离后进行GC‑MS 分析。本发明专利技术方法改良了现有技术中关于实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法，使得整个检测时间从原来的12‑24 h缩短到2‑3 h，大大增强了时效性。此外，本发明专利技术方法可以浸提获得种类更多的表皮碳氢化合物组分，为进一步鉴定实蝇的种类尤其是近缘种提供更为详实而可靠的数据支持。

A method for the determination of cuticular hydrocarbons in larvae of the fly

The invention discloses a method for analyzing cuticular hydrocarbon components of fly larvae, belonging to the field of inspection and quarantine. The method of the invention is to fly larvae along the dorsal line from the head end of the abdomen or the anus will cut the whole body, remove the parasite containing material, rinse, adding proper amount of organic solvent, fast full extraction of 1 4 grinding min, then add the amount of organic solvent, extracting 1 5 min, collect all the extracts; analysis of GC MS conducted column separation. The method of the invention has improved the analysis method on fruit fly larvae of cuticular hydrocarbons in the prior art, the detection time from the original 12 24 h shortened to 2 3 h, greatly enhance the timeliness of. In addition, the method of the invention can extract more species of cuticular hydrocarbon components and provide more detailed and reliable data support for further identification of the species of the fly, especially the related species.

【技术实现步骤摘要】
一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法
本专利技术属于检验检疫领域，具体涉及一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法。
技术介绍
实蝇类昆虫繁殖力强、危害隐蔽且严重，是一类重要的检疫性昆虫，备受国内外检疫部门关注。准确快速地识别实蝇，对口岸果蔬快速通关及阻止其入侵，避免农业生产受到重大经济损失具有重大意义。在口岸检疫过程中，对昆虫的鉴定主要以传统形态学鉴定技术为主，一般通过昆虫分类最基本和可靠的特征，例如，形态和大小、色泽、斑纹和刻纹等，直接用眼睛或借助光学显微镜观察。传统形态学鉴定的缺点在于：由于实蝇的生活环境不同，实蝇的生态特征，如斑纹、颜色等也随之发生变化，给形态学鉴定带来了困难甚至错误，对一些隐种不能很好地鉴定区分，而且形态学上的鉴定需要专门的人员才能完成。同时，从受害的瓜果中截获到的实蝇多数是卵、幼虫和蛹，而多数的实蝇的卵，幼虫和蛹在形态学上无明显差别，难以鉴定到种。因此检疫部门只能将截获到的实蝇饲养到成虫后，才可能基于其形态鉴别特征确定其种类。显然，这一检疫程序费时耗力，难以满足进口瓜果快速鉴定通关的要求，同时也影响了下一步应急快速反应，预警测报和防治的效果。除了使用形态学鉴定技术外，还可以通过分子生物学手段，如同工酶电泳技术、限制性片段长度多态性标记技术、随机扩增多态性DNA技术、核酸序列及微卫星DNA分析等技术。分子生物学手段缺点在于：利用这些方法存在着许多的缺陷，例如使用同工酶电泳技术时，其结果的重现性差，而且样品酶易受昆虫发育阶段和保存条件的影响。对于一些实蝇的复合种或隐种的鉴定，分子生物学手段就存在着一些局限性，其能否对复合种进行鉴定还未见报道。此外，进行分子生物学实验时需要进行大量的准备工作，操作复杂，而且费用相对较高。最后，还有利用昆虫表皮碳氢化合物作为昆虫分类工具对昆虫进行鉴定。昆虫的表皮碳氢化合物的组成具有种的特异性，不同昆虫所产生的表皮碳氢化合物不同，是昆虫的独立和特异的表型特征。与形态分类特征相比，作为生化特征的表皮碳氢化合物是对生命本质不同侧面的反映，具有很高的多态性可供选择，是形态学鉴定的补充，尤其适用于形态相似的近缘种和隐种的鉴定。利用昆虫表皮碳氢化合物鉴定昆虫有其独特的优势，①不受实验样品的限制，新鲜、干燥或冷冻标本均用于分析；②整体浸泡不损坏昆虫的外部形态，可以继续保存标本；③提取液性质稳定，保存时间对实验结果无影响；④实验条件较简单，费用相对较低，实验周期短，实用性高。利用气相色谱质谱联用(GC-MS)技术，对昆虫表皮碳氢化合物(CHCs)进行分析，通过对CHCs的组分与含量的分析，找出特有峰来区分不同种的实蝇，并且建立相应的指纹图谱，可以在检验检疫过程中提供快速的鉴定方法。分析昆虫表皮碳氢化合物最常用的两种方法为有机溶剂浸提法和固体进样法。现有技术中，有机溶剂浸提法分析实蝇幼虫表皮碳氢化合物时多采用有机溶剂正己烷直接浸泡过夜提取，然后进行GC-MS分析，但是这种方法能萃取出的化合物的种类和含量偏少，特别是一些含量较少的物质尚无法检测出，其结果不能真正反映幼虫表皮的化合物特征属性。此外，现有技术中的取样浸提方法不仅操作复杂、耗时、不环保，难以提取出表皮碳氢化合物，而且提取的时间很难掌握，如果提取时间太短，由于表皮水分的封锁，不能充分地提取昆虫体表较深层的碳氢化合物；如果提取时间过长，由于昆虫体内物质经由口器或肛门逸出，可能把体内的物质也提取出来，两种情况都会影响检测结果。固体进样法通常被用于食品农残检测或挥发性气体测定等。我们此前已经报道了利用固体进样法对桔小实蝇成虫表皮碳氢化合物的图谱分析(“一种可用于桔小实蝇表皮碳氢化合物分析的固体进样技术”,昆虫学报,2016,59(3):278-291)，探讨了利用桔小实蝇成虫附肢或虫体的头、胸、腹部等作为固体进样样品的可操作性。但口岸截获的实蝇类昆虫多为钻蛀果蔬并在其内为害的幼虫，而目前对于实蝇幼虫的鉴定，仍存在技术问题，即使实蝇分类学家也不能准确对幼虫做出鉴定，因此在多数情况下需将其饲养至成虫，再根据成虫形态特征进行种类鉴定，或者借助分子生物学技术。采用固体进样法，则幼虫体内的物质容易污染色谱柱，同时也影响物质的分析，此外只取幼虫部分表皮并不能反应整个虫体的化合物特征。因此，实蝇幼虫鉴定技术的缺乏，使得检验检疫过程中鉴定的时效性受到影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法，包括下列步骤：1)将实蝇幼虫沿着背侧线从头部或腹末肛门处将整个虫体剪开，去除虫体内含物，漂洗干净，得到实蝇幼虫表皮；2)取实蝇幼虫表皮添加适量有机溶剂，快速充分的研磨提取1-4min，然后再加入等量的有机溶剂，浸提1-5min，收集所有浸提液；3)将浸提液加入分离柱中，利用有机溶剂洗脱，收集所有洗脱液，浓缩，保存备用；4)对浓缩洗脱液进行GC-MS分析。本专利技术方法适用于实蝇所有种类的幼虫，其中，包括桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、木瓜实蝇、番石榴实蝇等幼虫。优选的，步骤1)中，实蝇幼虫为2-3龄的实蝇幼虫。优选的，步骤1)中，将实蝇幼虫沿着背侧线从头部将整个虫体剪开，采用镊子直接将内含物拖出的方法去除虫体内含物。优选的，步骤1)中，将实蝇幼虫沿着背侧线从腹末肛门处将整个虫体剪开，采用扁头镊子刮去内含物的方法去除虫体内含物。虫体内含物包括嗉囊、前胃、中肠、马氏管、后肠等。幼虫体内的物质容易污染色谱柱，同时也影响表皮物质的分析，采用本专利技术的方法可以较好地去除虫体内含物。优选的，步骤1)中，去除虫体内含物后，还需挤压幼虫表皮，尽可能除尽游离的脂肪体。优选的，步骤1)中漂洗时采用镊子夹着虫体，用洗瓶冲洗后，再置于培养皿中用蒸馏水漂洗干净，得到实蝇幼虫表皮。本专利技术采用去除内含物、挤压幼虫表皮，并进一步漂洗干净的方法，基本可以将幼虫体内的物质去除干净。如果还有微量的残留物，可以通过本专利技术后续的过柱处理来去除。优选的，步骤2)中取1-3头实蝇幼虫表皮添加适量有机溶剂。优选的，步骤2)中取1头实蝇幼虫表皮添加适量有机溶剂。优选的，步骤2)中，有机溶剂的添加量为每头实蝇幼虫添加0.5-3ml的有机溶剂。本专利技术的技术优势在于单头幼虫即可供鉴定，实验所需的材料成本大大降低，而且时间缩短。优选的，步骤2)和步骤3)中，有机溶剂包括正己烷、正戊烷。优选的，提取和洗脱的所用的有机溶剂一致。优选的，步骤2)中，研磨时所使用的研钵的材质包括陶瓷，玻璃和玛瑙，研磨时适当遮盖，以防有机溶剂挥发。优选的，步骤3)中，分离柱中的固定相为硅镁型吸附剂和无水硫酸钠按照质量比为(2-5):(1-3)混合得到。优选的，步骤3)中，分离柱中的固定相为硅镁型吸附剂和无水硫酸钠按照质量比为3:2混合得到。本专利技术中最少仅需取1头实蝇的表皮碳氢化合物进行分析即可，所添加的溶剂不超过10ml，这里所搭配的分离柱管长为100mm，分离柱中的固定相为硅镁型吸附剂和无水硫酸钠按质量比混合，其中硅镁型吸附剂0.3g，无水硫酸钠0.2g。过柱是为了去除有机溶剂提取出的一些非碳氢化合物的物质。我们优选出的固定相不会对碳氢化合物产生影响，如果利用其他类型的固定相，可能会吸附碳氢化合物，影响实验结果。优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法，其特征在于：包括下列步骤：1）将实蝇幼虫沿着背侧线从头部或腹末肛门处将整个虫体剪开，去除虫体内含物，漂洗干净，得到实蝇幼虫表皮；2）取实蝇幼虫表皮添加适量有机溶剂，快速充分的研磨提取1‑4 min，然后再加入等量的有机溶剂，浸提1‑5 min，收集所有浸提液；3）将浸提液加入分离柱中，利用有机溶剂洗脱，收集所有洗脱液，浓缩，保存备用；4）对浓缩洗脱液进行GC‑MS 分析。

【技术特征摘要】
1.一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法，其特征在于：包括下列步骤：1）将实蝇幼虫沿着背侧线从头部或腹末肛门处将整个虫体剪开，去除虫体内含物，漂洗干净，得到实蝇幼虫表皮；2）取实蝇幼虫表皮添加适量有机溶剂，快速充分的研磨提取1-4min，然后再加入等量的有机溶剂，浸提1-5min，收集所有浸提液；3）将浸提液加入分离柱中，利用有机溶剂洗脱，收集所有洗脱液，浓缩，保存备用；4）对浓缩洗脱液进行GC-MS分析。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：步骤1）中，实蝇幼虫为2-3龄的实蝇幼虫。3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：步骤1）中，将实蝇幼虫沿着背侧线从头部将整个虫体剪开，采用镊子直接将内含物拖出的方法去除虫体内含物。4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：步骤1）中，将实蝇幼虫沿着背侧线从腹末肛门处将整个虫体剪开...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷妍圆，林涛，吕利华，齐国君，陈婷，何余容，
申请(专利权)人：广东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44