将分子递送到细胞的方法和载体复合物技术

本发明专利技术涉及用于递送分子到细胞的载体复合物和方法。根据本发明专利技术该载体复合物包括分子和芳香族阳离子肽。在一个具体实施方式中，用于递送分子到细胞的方法包括使载体复合物与细胞接触。在另一个具体实施方式中，该用于递送分子到细胞的方法包括将分子和芳香族阳离子肽与细胞接触。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求于2003年5月1日提交的序列号为60/467,516的美国临时申请的优先权。序列号为60/467,516的美国临时申请的说明书的全部内容以引用方式结合于本文。本专利技术系在批准号为P01-DA-08924的来自国家药物滥用研究所的政府支持下完成的。美国政府对本专利技术拥有一定权利。
技术介绍
生物细胞对于被允许穿过细胞膜的分子通常是高选择性的。因此，将例如小分子和生物分子这样的化合物递送(或运送)进入细胞，通常受限于该化合物的物理性质。该小分子和生物分子可以是，例如，具有药物活性的化合物。这样的分子(包括大分子，如蛋白质和核酸)在体内被递送至细胞内的不足，已经成为大量潜在有效的化合物在治疗、预防和/或诊断中的应用的障碍。此外，因为在体内缺乏将化合物有效地递送到细胞内的能力，许多在体外看来很有前途的化合物已经作为潜在的药物而被放弃了。许多报导都已提及通过共价地将化合物附着到“蛋白转导结构阈”(PTDs)而将化合物递送至细胞的问题。Schwarze等(TrendsPharmacol Sci.2000；2145-8)和授权给Dowdy的美国专利第6,221,355号披露了几种能够以浓度依赖性的方式穿过细胞的脂质双层的PTDs。所披露的PTDs包括来源于HIV-1tat蛋白、来源于由触角足(简写为ANTP)基因编码的果蝇同型转录因子、以及来源于单纯疱疹病毒VP22转录因子的PTDs。HIV-1 tat PTD的长度为十一个氨基酸，ANTP PTD的长度为十六个氨基酸，而VP22 PTD的长度为34个氨基酸。然而，最近出版的资料显示这些PTDs经由能量依赖性的胞吞作用而进入细胞。因此，“PTD-运载物”复合物包括在细胞内涵体的小泡内，而不存在于例如细胞的胞质。因此，该“PTD-运载物”复合物必需从内涵体的小泡释放，以便具有生物活性(Richard et al.，J Biol.Chem.2003；278585-590；Drin et al.，J Biol.Chem.2003；27831192-31201)。此外，最近的报导表明PTDs对细胞是有毒性的。因此，需要有能够以不依赖能量的非胞吞方式穿过细胞的脂质膜的肽。此外，为了避免通常周知的对较大的肽的免疫反应，需要有较小的、耐肽酶的肽。最后，所述肽载体对于细胞没有毒性，这也是很重要的。
技术实现思路
通过本专利技术提供的一种用于将分子递送到细胞的方法，从而满足了这些要求。本方法包括将载体复合物与所述细胞接触，其中该载体复合物包括所述分子和芳香族阳离子肽，并且其中该芳香族阳离子肽包括(a)至少一个净正电荷；(b)最少三个氨基酸；(c)最多十个氨基酸； (d)净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为，其中3pm是小于或者等于r+1的最大数；以及(e)芳香基团的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为，其中3a是小于或者等于pt+1的最大数，除非当a为1时，pt也可以为1。在另一个具体实施例中，本专利技术提供了一种载体复合物，该载体复合物包括分子和芳香族阳离子肽，其中芳香族阳离子肽包括(a)至少一个净正电荷；(b)最少三个氨基酸；(c)最多十个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为，其中3pm是小于或者等于r+1的最大数；以及(e)芳香基团的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为，其中3a是小于或者等于pt+1的最大数，除非当a为1时，pt也可以为1。在另一个具体实施例中，本专利技术提供了一种用于将分子递送至细胞的方法。该方法包括将分子和芳香族阳离子肽与细胞接触，其中该芳香族阳离子肽包括(a)至少一个净正电荷；(b)最少三个氨基酸；(c)最多十个氨基酸； (d)净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为，其中3pm是小于或者等于r+1的最大数；以及(e)芳香基团的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为，其中3a是小于或者等于pt+1的最大数，除非当a为1时，pt也可以为1。附图说明图1.Caco-2细胞内肽的摄取。DALDA(A)和Gly-Sar(B)的摄取的时间过程。在37℃或者4℃下，Caco-2细胞与DALDA(250nM，47Ci/mmol)或者Gly-Sar(50μM，56.7mCi/mmol)孵育1小时。随后在溶解后的细胞中测定放射性。(C)将DALDA的积聚物进行酸洗的结果。Caco-2细胞与DALDA在37℃下孵育1小时。在细胞溶解前，对细胞进行酸洗，以便去除与细胞表面结合的放射性(物质)。(D)DALDA的浓度对DALDA摄取的影响。细胞在37℃下与一定浓度范围(1μM-3mM)的DALDA孵育1小时。所有的数据用三个独立单层的平均数±S.E.表示。其中误差棒(errorbar)不明显，它们比标记组更小。图2.pH和DEPC对Caco-2细胞内DALDA(A和C)和Gly-Sar(B和D)的摄取的影响。在37℃和不同pH条件下将Caco-2细胞与DALDA(250nM，47Ci/mmol)或Gly-Sar(50μM，56.7mCi/mmol)孵育1小时(A和B)。在37℃下将细胞与DALDA(250nM，47Ci/mmol)或Gly-Sar(50μM，56.7mCi/mmol)孵育1小时(C和D)之前，在25℃将细胞与0.2mM DEPC预先孵育10分钟。所有的数据用三个独立的单层的平均数±S.E.表示。图3.(A)DALDA在不同的细胞系中的摄取。在37℃将细胞与DALDA(250nM，47Ci/mmol)孵育1小时。在细胞溶解前，将细胞酸洗，以便除去细胞表面结合的放射性。数据显示了代表耐酸的放射性，并且用三个独立的单层的平均数±S.E.表示。(B)DALDA与细胞膜的特异性结合。在25℃将从SH-SY5Y细胞和Caco-2细胞制备的细胞膜与DALDA(15-960pM)孵育1小时。通过1μM未标记的DALDA的包含物评估非特异性结合。通过快过滤将游离的放射性配体与结合的放射性配体分离。没有看到与Caco-2细胞的特异性结合。对于SH-SY5Y细胞，Kd值是118pM(范围是87-149)，而Bmax值是96fmol/mg蛋白质。图4.(A)DALDA(填充柱)和Gly-Sar(空心柱)的泄漏。在37℃或4℃用DALDA(250nM，47Ci/mmol)或Gly-Sar(50μM，56.7mCi/mmol)将Caco-2细胞预先加载1小时。随后用培养基冲洗细胞，并在37℃或4℃与培养基孵育1小时。在培养基和细胞溶解产物中均测定放射性，而数据用泄漏入培养基中的肽的百分数表示。(B)DEPC对DALDA泄漏的影响。在用DALDA加载前，在25℃将细胞与0.2mMDEPC预先孵育10分钟。(C)异搏定，一种p-糖蛋白抑制剂，对DALDA的泄漏(C)和摄取(D)的影响。图5.DALDA和Gly-Sar穿过Caco-2单层的转运。将Caco-2细胞(2×105)接种在转孔细胞培养容器内的多微孔膜上。通过将DALDA或者Gly-Sar加入到顶部隔间来测定肽从顶部到底侧的转运，并且在加入肽后的不同时间将20-μl等分试样从顶部和底侧隔间移出，以便测定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将分子递送到细胞的方法，所述方法包括将载体复合物与所述细胞接触，其中所述载体复合物包括所述分子和芳香族阳离子肽，其中所述芳香族阳离子肽包括：（ａ）至少一个净正电荷；（ｂ）最少三个氨基酸；（ｃ）最多十个氨基酸； （ｄ）净正电荷的最小数目（ｐ↓［ｍ］）与氨基酸残基的总数（ｒ）之间的关系为：其中３ｐ↓［ｍ］是小于或者等于ｒ＋１的最大数；以及（ｅ）芳香基团的最小数目（ａ）与净正电荷的总数（ｐ↓［ｔ］）之间的关系为：其中３ａ是小于或者等于ｐ↓［ ｔ］＋１的最大数，除非当ａ为１时，ｐ↓［ｔ］也可以为１。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：黑兹尔塞托，赵克胜，亚历克斯V比尔克，休D罗伯逊，
申请(专利权)人：科内尔研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]