一种测定水解酶活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定水解酶活性的方法。所述方法通过将含有底物、Fe

Method for measuring hydrolytic enzyme activity

The present invention discloses a method for determining the activity of hydrolases. The method comprises the inclusion of a substrate, an Fe

【技术实现步骤摘要】
一种测定水解酶活性的方法
本专利技术属于生物分析
，涉及一种测定水解酶活性的方法，具体涉及一种基于比色分析测定水解酶活性的方法。
技术介绍
水解酶是催化水解反应的一类酶的总称，广泛存在于各种动物、植物及微生物中。简便、快速和灵敏地测定水解酶的活性，对于疾病的早期诊断、疗效观察和预后监测具有极其重要的意义。目前，对于水解酶的活性测定多采用荧光分析法和比色分析法。其中，比色分析法，又称吸光光度法，是基于溶液颜色的深浅变化，即溶液对光的选择性吸收，来对物质含量进行定量分析的方法，具有检测成本低、设备简单、操作简便、准确度高和适合大批量样品等优良特性。以β-半乳糖苷酶为例，目前可用于其活性测定的比色分析方法有以下两类：(1)以对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(或邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)为显色底物，由于β-半乳糖苷酶可以将其水解生成对硝基苯酚(或邻硝基苯酚)，后者的溶液在碱性条件下为黄色且在405nm(或420nm)处有最大吸收峰，从而实现对β-半乳糖苷酶活性的比色分析，但是存在选择性差，灵敏度低，检测范围窄和抗干扰能力不足等缺陷；而且，由于底物稳定性差，容易造成“假阳性”结果(1.MaruhnD.(1976).Rapidcolorimetricassayofβ-galactosidaseandN-acetyl-β-glucosaminidaseinhumanurine[J].ClinicaChimicaActa,73(3):453-461；2.Gary,R.K.,Kindell,S.M.(2005).Quantitativeassayofsenescence-associatedβ-galactosidaseactivityinmammaliancellextracts.AnalyticalBiochemistry,343(2),329-334.)；(2)以纳米金为探针，基于纳米金聚集状态发生改变引起溶液颜色发生改变的性质，实现对β-半乳糖苷酶活性的比色分析，但是存在探针制备过程复杂，检测周期长，成本高和抗干扰能力差等缺陷(ZengZ.,etal.(2012).Simpleandreal-timecolorimetricassayforglycosidasesactivityusingfunctionalizedgoldnanoparticlesanditsapplicationforinhibitorscreening.AnalyticalChemistry,84(21),9089-9095；ChenJ.,etal.(2016).ColorimetricDetectionofEscherichiacoliBasedontheEnzyme-InducedMetallizationofGoldNanorods.Small,12(18),2469-2475.)。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种测定水解酶活性的方法，该方法基于比色分析测定水解酶活性，灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，可重现性好，操作简单，检测时间短，成本低廉，可用于水解酶活性的临床检测。本专利技术的技术方案如下：一种测定水解酶活性的方法，包括以下步骤：将含有底物、Fe3+和红菲绕啉二磺酸钠的检测液与待测水解酶溶液孵育，生成Fe2+-红菲绕啉复合物，测定反应液在535nm处的光吸收强度，根据光吸收强度与水解酶活性的标准曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性；所述的底物为非还原性底物，与待测水解酶反应生成还原性产物。所述的水解酶选自β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、碱性磷酸酶、中性磷酸酶或酸性磷酸酶。所述的水解酶为β-半乳糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷。所述的水解酶为α-半乳糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷。所述的水解酶为α-葡萄糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷。所述的水解酶为β-葡萄糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。所述的水解酶为α-甘露糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷。所述的水解酶为β-甘露糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷。所述的水解酶为碱性磷酸酶时，底物可以是抗坏血酸-2-磷酸。所述的水解酶为中性磷酸酶时，底物可以是抗坏血酸-2-磷酸。所述的水解酶为酸性磷酸酶时，底物可以是抗坏血酸-2-磷酸。本专利技术的测定水解酶活性的方法，底物不具有还原性，不能将Fe3+还原成Fe2+，底物在水解酶的作用下能够生成还原性产物，产生的还原性产物能将Fe3+还原成Fe2+，Fe2+与红菲绕啉二磺酸结合形成Fe2+-红菲绕啉复合物。在含有底物、Fe3+和红菲绕啉二磺酸钠的检测液与待测水解酶溶液孵育过程中，底物与水解酶反应生成还原性产物，还原性产物将Fe3+还原成Fe2+，Fe2+与红菲绕啉二磺酸钠以1:3的配比结合形成稳定的Fe2+-红菲绕啉复合物，Fe2+-红菲绕啉复合物在535nm处有很强的特征吸收峰。本专利技术通过测定反应液在535nm的吸收强度，最终根据光吸收强度与水解酶活性的标准曲线关系，得到待测水解酶溶液中水解酶的活性。本专利技术只需一步操作即可实现对水解酶活性的测定，具有灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，可重现性好，操作简单，检测时间短和成本低廉等优点，可用于临床样品中水解酶活性的快速、高灵敏检测，极大地降低了检测成本。附图说明图1是实施例1中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加β-半乳糖苷酶，c为不加对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。图2是实施例2中检测信号与β-半乳糖苷酶活性之间的关系曲线图。图3是实施例3中含有不同蛋白质样品的检测液在535nm处吸收值的比较图，其中，a为β-半乳糖苷酶，b为凝血酶，c为胰蛋白酶，d为血红蛋白，e为人血清白蛋白，f为球蛋白，g为淀粉酶，h为碱性磷酸酶，i为空白对照。图4是实施例4中检测信号与β-半乳糖苷酶活性之间的关系曲线图。图5是实施例5中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加α-半乳糖苷酶，c为不加对氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。图6是实施例6中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加α-葡萄糖苷酶，c为不加对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。图7是实施例7中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加β-葡萄糖苷酶，c为不加对氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。图8是实施例8中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加α-甘露糖苷酶，c为不加对氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。图9是实施例9中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加β-甘露糖苷酶，c为不加对氨基苯基-β-D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定水解酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有底物、Fe

【技术特征摘要】
1.一种测定水解酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有底物、Fe3+和红菲绕啉二磺酸钠的检测液与待测水解酶溶液孵育，生成Fe2+-红菲绕啉复合物，测定反应液在535nm处的光吸收强度，根据光吸收强度与水解酶活性的标准曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性；所述的底物为非还原性底物，与待测水解酶反应生成还原性产物。2.根据权利要求1所述的测定水解酶活性的方法，其特征在于，所述的水解酶选自β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、碱性磷酸酶、中性磷酸酶或酸性磷酸酶。3.根据权利要求1所述的测定水解酶活性的方法，其特征在于，所述的水解酶为β-半乳糖苷酶，底物为对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷。4.根据权利要求1所述的测定水解酶活性的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔金明，胡琼，何玟辉，梅亚琦，张学记，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32