本发明专利技术公开了葎草花粉主要致敏蛋白，该蛋白可从葎草花粉中分离获得，其能与８９％以上葎草花粉过敏病人血清特异性ＩｇＥ结合，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定其表观分子量约为１２ｋＤａ，等电点为４．７，Ｎ端序列为：ＮＨ↓［４］↑［＋］－ＭＤＮＰＦＥＮＧＭＫＡ－ＣＯＯ↑［－］。该蛋白的分离纯化为其变应原制剂标准化的实现奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及萚草花粉主要致敏蛋白。
技术介绍
花粉症在世界各国的发病率从1%~25%不等，多项流行病学 调查结果显示花粉症患者约占全世界总人口的10%~15%，但我 国目前尚无全国普通人群花粉症发病率的流行病学数据。30年前对 局部地区少数普通人群做花粉症流行病学调查显示其发病率可达 5%问。上世纪八十年代由叶世泰、乔秉善牵头全国数十家医院完成的 中国气传致敏花粉调查显示，很多地区夏秋季空气中萚草花粉的含 量仅次于蒿属花粉。 1989-1992年，尹佳、叶世泰在对北京地区九 种夏秋季花粉的临床研究中证实萚草花粉是引起我国北方地区夏 秋季花粉症的重要原因，同时在国内首次应用鼠抗人IgE单克隆抗 体建立了人血清萚草花粉特异性IgE的检测方法，并在1995年美 国变态反应和临床免疫学年会上向世界首次报告萚草花粉是中国北 方地区夏秋季花粉症的重要原因,。尹佳等近年对1120例夏秋季花粉症患者发病情况研究显示萚 草花粉在我国夏秋季花粉症患者中的阳性百分比高达66% (739/1120)，我国夏秋季花粉(蒿和萚草花粉)诱发的过敏性鼻炎 平均发病年龄为27岁，哮喘的平均发病年龄为32岁;而 赵京等在北京地区13 ~ 14岁儿童呼吸道过敏性疾病流行病学调查中 发现蒿属花粉敏感者为5.7%,萚草花粉敏感者为4.2 %;据此 推测萚草花粉症患者在我国普通人群中的比率应超过5%,即约超 过650万人患有萚草花粉症。萚草是一年生缠绕草本植物，花期7-9月，果期9-10月，生于 城巿与乡村的沟边、路旁、庭院附近及田野间、石砾质沙地及灌丛 间，生命力极强，为我国常见的杂草，除新疆、青海以外的各个省 区均有分布，曰本、朝鲜、俄罗斯也有分布。萚草花粉是我国夏秋季重要的致敏花粉，可诱发严重的夏秋季鼻炎、结膜炎和哮喘。在我国人群中，15 34岁是夏秋季花粉诱发 鼻炎的高发年龄段，25 44岁是哮喘的高发年龄段，在全部夏秋季 花粉症患者中，37%在5年内，47%在9年内可发展为季节性哮喘， 由于这部分患者由鼻炎发展至哮喘多集中在25 54的青壮年阶段， 且其进程需经历5 10年，因此在34岁以前，夏秋季花粉症患者中 单纯鼻炎的比例较高；35岁以后哮喘的比例增高，但也有18%的患 者鼻炎和哮喘在同一年首次发作，部分患者因夏秋季花粉诱发的哮 喘症状非常严重，在其诱发的季节性哮喘患者中，77.9%需口服平喘 药物；77.7%夜间不能平卧；30.4%需要急诊输入氨茶碱或糖皮质激 素类药物治疗。近一半的夏秋季花粉症患者有可能在首次发病 的9年内发展为季节性过敏性哮喘是一个不容忽视的临床问题。夏 秋季花粉过敏性鼻炎和过敏性哮喘发病的高峰年龄正值人生精力充 沛、为社会创造财富的阶段，因此，寻求阻止和干预夏秋季花粉过 敏性鼻炎向哮喘发展的时机与方法非常重要。世界卫生组织在关于过敏性疾病免疫治疗的指导性文件中指 出，特异性免疫治疗是目前唯一能够阻止过敏性疾病自然进程的治 疗方法。因此，对夏秋季花粉诱发的严重过敏性鼻炎患者应尽早开 始特异性免疫治疗，防止其发展为哮喘；对已有哮喘的患者，更应 积极进行特异性免疫治疗，防止哮喘进一步加重。萚草花粉过敏原诊断和治疗制剂是诊断和治疗因萚草花粉诱发 的鼻炎和哮喘的关键药剂，而在生产和应用此药剂过程中需确保每 一批产品生物效价一致、主要致敏蛋白含量一致，因此，花粉主要致敏蛋白是制定标准化制剂的核心之一。主要致敏蛋白还是未来人工合成花粉诊断和治疗制剂的核心。 获得用主要致敏蛋白制备的单克隆抗体，将可检测药物和生物制剂中萚草花粉主要致敏蛋白含量，确定药物剂量和浓度。目前对萚草花粉致敏蛋白的研究很有限。孙秀珍等釆用SDS-PAGE、免疫印迹等方法分析萚草花粉致敏蛋白，发现在含有的 至少10种蛋白成分中有5种致敏蛋白，分子量分别为8.0、28.8、35.1、 42.0、 55.0、 65.0、 76.2、 100.5kDa，其中8.0 kDa的蛋白能与84.6%萚草花粉过敏哮喘患者血清中slgE结合，是主要致敏蛋白，而11.8~ 23kDa的蛋白虽然含量占优势但此分子量范围的蛋白既无变应原性 也无免疫活性，与哮喘和皮试阳性反应的关系不大。Park JW"嗜发现萚草花粉含有10、 16、 20、 29、 42kDa的5 种致敏蛋白成分；其中10kDa的蛋白质可能是主要致敏蛋白(与萚 草花粉过敏病人血清slgE的阳性结合率为72% )，对10kDa致敏蛋 白的N端氨基酸序列分析未发现其与目前所鉴定的致敏蛋白存在同 源性，其等电点大致为pI5丄而韩国另一位学者Park HS同研究显 示，13、 70、 80kDa蛋白是萚草花粉的主要致敏蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供萚草花粉的主要致敏蛋白。 本专利技术的蛋白是从萚草花粉中分离纯化得到，能与89%以上萚 草花粉过敏病人血清特异性IgE结合，通过SDS-PAGE测定其表观 分子量为12kDa,等电聚焦实验测定其pl=4.7, N端序列分析表明 其N端序列为NH/-MDNPFENGMKA- COCT。本专利技术以萚草花粉作为原材料，制备蛋白粗提液，经SDS-PAGE 电泳及免疫印迹实验表明12kDa处的蛋白为蓰草花粉主要致敏蛋 白，其与萚草花粉过敏病人血清sIgE的阳性反应率达到89呢。将制 备的粗提液通过凝胶分子排阻层析收集得到10~38kDa分子量区域的蛋白，最后通过阴离子交换层析得到4个洗脱峰，经电泳分析表明，第四个洗脱峰蛋白分子量为12kDa, —系列体外免疫学实验表明其确为萚草花粉主要致敏蛋白。进一步对收集得到的主要致敏蛋白进行N末端序列分析，其N端氨基酸序列为 NH/-MDNPFENGMKA-COO-,经检索，未发现相同蛋白，表明所 获得的蛋白为一个新蛋白，现将该蛋白命名为Humsl。本专利技术还进一步将获得的蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠， 取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，最后筛选得到能稳定分泌单克隆抗体 的杂交瘤细胞株。通过上述得到的单克隆抗体，还可以进一步构建免疫检测试剂盒。萚草花粉变应原制剂的标准化是以对其中致敏蛋白组分分子水 平的深入认识为前提，萚草花粉主要致敏蛋白的分离纯化为其变应 原制剂标准化的实现奠定了基础，其用途和意义表现在如下几个方 面1) 以此作为天然标准品，用于萚草花粉变应原制剂标准化中主 要致敏蛋白定量方法的建立，从而有利于萚草花粉变应原制剂中主 要致敏蛋白的定量标示，并将主要致敏蛋白的含量作为一个重要参 数衡量各批次变应原制剂间的差异；2) 将此主要致敏蛋白作为萚草花粉症特异性诊断的生物标记 物，并以此开发相应的体内/体外特异性诊断用试剂盒，包括被用于 变应原蛋白芯片检测技术；3) 用于三维结构的分析和抗原决定簇的测定；4) 有利于具有相同致敏性或低致敏性的重组主要致敏蛋白的获得。附图说明图1是28例萚草花粉阳性血清对萚草花粉粗提液的免疫印迹结果，其中1~28是28例患者血清各自的免疫印迹条带，a为来源于 28例阳性血清的混合血清，b为健康志愿者血清对照，c为空白对照， M为蛋白分子量标准，由上至下分别为97.0, 66.0, 45.0， 30.0， 20.1， 14.4kDa;图2是凝胶分子排阻层析中目标收集组分的S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从葎草花粉中分离纯化得到的经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定表观分子量约为１２ｋＤａ的致敏蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：尹佳，李宏，程璇，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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