本发明专利技术公开了一种制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法。本发明专利技术所提供的制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法，是以盐酸硫醇亚胺为巯基化试剂，将抗体巯基化，再将所述巯基化抗体固定到微悬臂梁的金膜上，得到修饰有抗体的微悬臂梁。结果表明，通过巯基化试剂－盐酸硫醇亚胺的引入，本发明专利技术的制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法与现有的方法相比具有反应时间短、操作简单、抗体活性损失少等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
随着原子力显微镜(AFM)和微机电系统(MEMS)的出现，微悬臂梁传感技术 迅速发展成为一种新的传感方法，其原理是当微悬臂梁表面发生生化反应时会产 生表面应力的改变，从而导致微悬臂梁产生弯曲变形，结合光学或电学方法监测这 种变形，就可以知道整个生化反应进行过程的信息。通过依靠免疫特异性识别建立 的微悬臂梁免疫传感技术与传统的酶联免疫吸附测定技术(ELISA)相比，该项技 术在检测时无需对待测样品进行标记，消除了可能由标记产生的附加影响，且灵敏 度高，可实现实时、并行的监测整个生化反应的发生过程，从而得到更丰富的生物 信息，容易实现大尺度、高通量、平行阵列测量的显著优势，特别适用于难于标记 的示踪物，如荧光素或示踪同位素的被检测靶分子。近年来，微悬臂梁免疫传感技 术在癌症检测、DNA杂交和转录因子等方面都得到了广泛的应用。微悬臂梁免疫传感技术应用的关键，是如何将灵敏度高、特异性强的抗体有效 的结合到微悬臂梁的金膜上并尽量保持抗体的活性。关于将抗体固定到微悬臂梁上 对微悬臂梁进行修饰的方法，国内外文献报道的方法主要是通过具有双功能基团的 巯基化试剂进行的，主要方法有以下两类第一类方法是先将巯基化试剂结合到微 悬臂梁上，然后活化巯基化试剂上的羧基或氨基，使之与抗体上的氨基或羧基结合， 所用巯基化试剂如11-羧酸硫醇(11-MUA)、2-氨基乙硫醇(AET)或3-巯基丙酸(MPA)。这类办法增加了活化步骤，影响抗体固定的稳定性与一致性，同时会使抗体的活性 降低，结果的重复性较差；另外，巯基化试剂活化后与抗体反应持续的时间也较长， 一般需要3-5小时左右。第二类方法是先将抗体进行巯基化，然后再结合到微悬臂 梁的金膜上，巯基化试剂以磺基羟基琥珀酰亚胺基-6- (3'，2-吡啶二硫-丙酰胺)-己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)和3, 3'-二硫双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯(DTSSP)为主。 这类办法的原理是在抗体与巯基化试剂反应后形成二硫键，再加入二硫苏糖醇 (DTT)还原出自由巯基，其缺点是由于抗体的重链与重链之间以及重链与轻链之 间有许多二硫键，用DTT还原时可能会破坏抗体的结构进而影响抗体的活性和微悬臂梁传感器的检测极限。此外，杯芳冠醚(Calixarene)衍生物ProlinkerTM等己在国外被申请专利。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供盐酸硫醇亚胺的一种新用途。本专利技术所提供的盐酸硫醇亚胺的新用途是其作为巯基化试剂在制备修饰有抗体的微悬臂梁中的应用。本专利技术的另一个目的是提供。 本专利技术所提供的制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法，是以盐酸硫醇亚胺为巯基化试剂，对抗体进行巯基化，得到巯基化抗体，再将所述巯基化抗体固定到带有金膜的微悬臂梁上，得到修饰有抗体的微悬臂梁上述方法中，所述抗体和所述盐酸硫醇亚胺的摩尔比为1: (1-6),具体为1:3。 上述方法中，所述抗体可为鼠、兔等动物源的多克隆抗体或单克隆抗体等，如抗克伦特罗单克隆抗体。可用现有的巯基化方法，利用所述巯基化试剂-盐酸硫醇亚胺对抗体进行巯基化。具体制备时，所述抗体和所述盐酸硫醇亚胺的反应条件为，室温下反应0. 5-2. 0h，具体可为室温下反应1 h。所述将巯基化抗体固定到微悬臂梁的金膜上的反应条件为，30. 0-37. 5'C反应0. 5-2. 0 h，具体可为37。C反应lh。利用上述任一方法制备的修饰有抗体的微悬臂梁也属于本专利技术的保护范围。 鉴于微悬臂梁免疫传感技术对抗体固定的重要性，本专利技术将盐酸硫醇亚胺作为巯基化试剂与抗体结合，然后将巯基化后的抗体固定到微悬臂梁上。结果表明，通过巯基化试剂-盐酸硫醇亚胺的引入，本专利技术的将抗体固定到微悬臂梁上的方法与现有的方法相比具有反应时间短、操作简单、抗体活性损失少等优点。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术的将抗体固定到微悬臂梁上的方法做进一步说 明，但不限制本专利技术。实施例l、制备修饰有抗体的微悬臂梁 1、利用盐酸硫醇亚胺将抗体巯基化(1)准确称取抗克伦特罗单克隆抗体(购自美国USBiological公司)10.0mg 溶于1. 0mL PBS中得到浓度为10g/L的抗体溶液；.(2) 称取2. 0 mg盐酸硫醇亚胺(购自美国Sigma公司)溶于1. OmL蒸馏水中 得到浓度为2. Og/L的巯基化试剂(现配现用)；(3) 将1.0mL上述步骤(1)的抗体溶液和45.8 pl上述步骤(2)的巯基化 试剂混合，使混合溶液中抗克伦特罗单克隆抗体和盐酸硫醇亚胺的摩尔比为1: 3， 室温条件下轻微搅拌反应lh;(4) 用20mM的PBS缓冲液(含0. 15M NaCl和1. OmM EDTA， pH7. 2)对上述步 骤(3)的反应液透析48h，期间每2h更换一次透析液，得到巯基化抗体溶液。2、 Ellmari，s法测定巯基化抗体中抗体和巯基基团的摩尔结合比(1) 称取100 mg 5， 5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)溶于25 mL 0. 1M PBS 缓冲液(pH 8.0)中；(2) 称取3. 5 mg半胱氨酸(Cys)溶于10mL 0. 1M PBS缓冲液(pH 8.0)中， 得到浓度为2. OmM的半胱氨酸(Cys)溶液；将上述浓度为2. OraM的半胱氨酸(Cys)溶 液用0. 1 M PBS缓冲液(pH 8. 0)依次稀释成浓度分别为1. 0 mM、 0. 5 raM、 0. 25 raM、 0. 125 mM和0. 0625 mM的半胱氨酸(Cys)溶液;(3) 取上述步骤(2)获得的不同浓度的半胱氨酸(Cys)溶液和上述步骤l获 得的巯基化抗体溶液各250 u L，分别加入50 ii L上述步骤(1)配制的DTNB溶液中， 充分混匀，室温条件下反应15分钟，412 nm处测量溶液的吸光值；(4) 以半胱氨酸(Cys)溶液的摩尔浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标 准曲线，计算上述步骤1获得的巯基化抗体中巯基的摩尔浓度，换算成每摩尔抗体 分子的巯基数，即得到巯基化抗体中抗体和巯基基团的摩尔结合比。实验设三次重复，结果表明，上述步骤1获得的巯基化抗体中抗克伦特罗单克 隆抗体和巯基基团的摩尔结合比为1: 3。3、 直接竞争ELISA方法测定抗体巯基化后活性的损失情况(1) 包被酶标板中每孔分别加入100uL稀释后的浓度为2.5ug/mL的抗克 伦特罗单克隆抗体与上述步骤1获得的巯基化抗克伦特罗单克隆抗体，37'C温育 3h;(2) 洗板倒掉上述步骤(1)的抗体溶液，将酶标板在滤纸上甩干，用200u L的洗涤液在自动洗板机上洗板4次，甩干；(3) 封闭每孔加入100uL质量百分含量为5。/。的BSA溶液(用PBS溶解)封 闭，37°(3温育30 min;(4) 洗板倒掉封闭液，将酶标板在滤纸上甩干，用200uL洗涤液在自动洗 板机上洗板4次，甩干；(5) 竞争每孔依次加入50uL浓度为50ng/mL的克伦特罗溶液(购自美国 Sigma公司)和浓度为1. 0 mg/L的克伦特罗辣根过氧化物酶联结物(购自美国Sigma 公司)，37。C温育竞争30 min;(6) 洗板倒掉反应液，将酶标板在滤纸上甩干，用200uL洗涤液在自动洗 板机上洗板4次，甩干；(7) 显色本文档来自技高网...
【技术保护点】
盐酸硫醇亚胺作为巯基化试剂在制备修饰有抗体的微悬臂梁中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王保民，谭伟明，南铁贵，何素平，刘威，赵洪伟，高巍，李召虎，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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