提供了用于提高以下至少一种的方法和组合物：（ｉ）靶蛋白对麦芽糖糊精底物的结合亲和力和／或（ｉｉ）靶蛋白的溶解度。所述方法和组合物涉及修饰的麦芽糖结合蛋白。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】与突变麦芽糖结合蛋白融合的靶蛋白的溶解和纯化背景当需要大量纯蛋白时，重组蛋白在生物技术中具有多种用途。微生物表达系统，如大肠杆菌和酵母通常是第一选择， 这是由于它们的低成本和高产率。当在大肠杆菌中表达异种蛋白时， 通常碰到蛋白的低水平表达和/或不溶的问题。即使蛋白充分表达并保 持可溶，其必须从细胞提取物的大量其它蛋白中纯化。要促进靶蛋白 的表达和纯化，通常使用的一种方法是对该蛋白融合亲和标记。好的亲和标记具有这样的性质——当融合到靶蛋白的N-末端时，其促进高 水平表达，并提供简单的一步亲和纯化，其允许靶蛋白从表达环境中 被纯化。大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白(MBP)通常被用作表达和纯 化大肠杆菌中产生的异种蛋白的亲和标记。MBP的天然功能是在外膜 孔蛋白结合麦芽糖糊精并在内膜将其释放到MalEFK转运元件 (transport apparatus)。 MBP的C-末端与耙蛋白的N-末端融合允许融 合蛋白在大肠杆菌中表达(附图说明图1)。 MBP禾BMBP融合体(ftision)可以 通过结合到色谱基质而在一步内被纯化，所述色谱基质含有大量葡萄 糖a-l—4-葡萄糖多糖中任意一种，如直链淀粉、淀粉或其它麦芽糖糊 精(美国专利5,643,758)。许多在其天然宿主(native host)中可溶的 蛋白当作为重组蛋白表达时不溶解。对于这些蛋白中的许多种来说， 与MBP融合使它们可溶(Kapust & ^Waugh， /Voto'" <Scz'. 8:1668-74 (1999))。 MBP作为亲和标记的用途被这样的事实减弱——取决于 MBP-靶蛋白纯化中的蛋白， 一些融合体既不能结合到亲和基质又不能 结合到其它。此外，非离子去污剂的存在，如Triton X100和Tween 20 会干扰结合，特别对于具有固有较低亲和性的MBP-靶蛋白融合体。5研究人员已经使用MBP的结构制备定向突变，以便改变 MBP的结合特性。MBP的X射线晶体结构已经由Spurlino等，J Ao/. C/7em. 266:5202-5219 (1991)报道。MBP包含两个结构域，在多糖结合 的结构域之间具有一个裂(cleft)。包含N-末端的结构域被称为N结构 域，而包含C-末端的结构域被称为C结构域。三个环跨在这两个结构 域之间，形成铰链区(hinge)。两个小组已经使用该结构在铰链区后面 的区域进行定向突变，提高了 MBP对麦芽糖和麦芽三糖的亲和性 (Marvin等，tV"/1"/ S化"c/^m/ 8:795-798 (200)；Telmer &Shilton， Jowma/o/S/o/. CTzew. 278:34555-34567 (2003))。然而，该方法 具有固有的缺点，因为对MBP的修饰提高了该蛋白表面的疏水性并因 此降低了其溶解性。这通过增大其使融合蛋白不溶的倾向而减小了其 作为亲和标记的用途。概述在本专利技术的一个实施方式中，提供了修饰的MBP融合蛋 白，其由具有突变的MBP氨基酸序列表征，其中所述突变使修饰的 MBP融合蛋白具有至少一种选自下列的特性(i)提高的对麦芽糖糊精 底物的亲和力及(ii)当与具有有限溶解性的靶蛋白融合时，提高的溶解 性。在本专利技术的又一实施方式中，修饰的MBP具有突变，其位于螺旋 XI和XII之间的铰链区，或在该蛋白A313的10人的区域内。例如， 突变可以位于C结构域或在S146的10人的区域内——在该蛋白的(3-折叠F的开端。该修饰具体可以是A313V或S146T。在本专利技术的又一实施方式中，修饰的MBP可以与靶蛋白融 合形成融合蛋白，并且可以，例如具有比与靶蛋白融合的未修饰MBP蛋白的溶解度更高的溶解度。在本专利技术的一个实施方式中，修饰的MBP可具有选自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列或编码该蛋白的DNA序列，所 述DNA序列选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5 。 DNA可以被插入载 体，如pKLACl载体，用于在诸如克鲁维酵母属(《/">n^raw_yc")或 大肠杆菌的宿主细胞中表达。在本专利技术的一个实施方式中，提供了一种用于纯化蛋白的方法，其包括在诸如克鲁维酵母属或大肠杆菌的宿主细胞中表达包 含上述修饰的MBP中任一种和靶蛋白的融合蛋白。修饰的MBP融合 蛋白被允许结合到诸如多糖的基质，所述多糖由麦芽糖糊精示例。融 合蛋白随后可以在选定的缓冲液中从该基质洗脱，以获得纯化蛋白。在本专利技术的又一实施方式中，提供了一种用于溶解靶蛋白 的方法，其包括表达融合到靶蛋白的MBP突变体，以至于融合蛋白被 溶解到大于在不存在突变MBP的情况下观察到的程度，和被溶解到大 于使用非突变MBP观察到的程度。突变的实例包括A313V突变和/或 S146T突变。附图简述图1示意性描述通过如下进行靶蛋白的克隆和纯化表达 编码与靶蛋白融合的MBP的DNA，允许该融合蛋白选择性地结合直 链淀粉，在含麦芽糖的缓冲液中洗脱靶蛋白并随后通过蛋白酶剪切从 纯化的融合蛋白中回收靶蛋白。图2提供了比较野生型MBP与修饰的MBP的序列。图2A:编码来自pMAL-c2X的野生型MBP(SEQIDNO:2) 的DNA序列(SEQIDNO:l)。图2B:编码MBP突变体A9 (SEQ ID NO:4)的DNA序 列(SEQIDNO:3)。修饰的MBP序列中的变化以粗体标识。图2C:编码MBP突变体G8-1 (SEQIDNO:6)的DNA序 列(SEQIDNO:5)。修饰的MBP DNA和氨基酸序列中的变化以粗体 标识。图3显示了比较使用野生型MBP (pK01483)或修饰的 MBP (A9或G8-l)的蛋白产率的柱形图。MBP的产率以mg/500ml培养物的形式提供。图4显示了在SDS-PAGE凝胶上从含有野生型MBP、MBP A313V和S146T修饰的pMAL中纯化的MBP-Klenow产物。质粒 WT=pIH1062， A313V=pIH1643， S136T=pIH1644。泳道CE^粗提物， FT-流过物(flowthrough)，且E4先脱物。等份的指明部分(indicated fraction)被加样于每个泳道。从A313V突变MBP中比从野生型MBP获得了明显更高的MBP融合蛋白的产率(也参见表l)。图5:用于表达MBP-CBD融合蛋白的pMB50的序列(SEQ IDN0:7)(参见表2)。图6: SDS-PAGE凝胶，显示了融合野生型和修饰的MBP 到DHFR和GAPDH对溶解性的影响。DHFR融合质粒WT=pIH1616， A313V=pIH1617， S146T=pIH1618， DM=pIH1646。 GAPDH融合质粒 WT=pIH1625， A313V=pIH1626， S146T=pIH1627， DM=pIH1645。泳道T:总细胞提取物，S-可溶提取物，1=不溶物质的重悬液。等份的指明部分被加样于每个泳道。与野生型MBPs相比，对两种突变体来 说可溶与不溶蛋白的比例都更高。图7提供了 pKLMF2-PMASal的序列(SEQ ID NO:8)。图8显示了使用支链淀粉树脂柱，从SDS-PAGE凝胶上融 合蛋白亲和纯化得本文档来自技高网...
【技术保护点】
修饰的麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ），其包括：具有突变的ＭＢＰ氨基酸序列，其中所述突变使所述修饰的ＭＢＰ，当融合于蛋白时，具有以下至少一项的提高：（ｉ）对麦芽糖糊精底物的结合亲和力；和（ｉｉ）当蛋白具有有限溶解度时的溶解度。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：PD里格斯，PC赫斯，I沃克，PA科卢西，M加奈特拉，CH塔龙，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。