本发明专利技术提供一种林蛙抗菌肽及其制备工艺，还进一步公开了该抗菌肽在制备抗病毒药物中的用途，该肽是一种碱性多肽，分子量范围在２－１６ＫＤａ之间，等电点为８．９－９．５，由天冬氨酸、谷氨酸、丝氨大多数酸、组氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、Ｖａｌ、甲硫氨酸等组成，其中碱性氨基酸占总量的２３．９９％，酸性氨基酸占总量的１９．０８％。林蛙抗病毒抗菌肽是从天然资源得到的产物，具有很好的抗病毒能力，同时还具有无溶血活性、无血浆凝固活性等优点，可用于制备抗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病的药物。
【技术实现步骤摘要】
-本专利技术提供一种林蛙抗菌肽，同时还提供了该抗菌肽的制备工艺，本专利技术还进一 步公开了该抗菌肽在制备抗病毒药物中的用途，属于生物化学与生物制药
技术介绍
很多两栖类动物在中国属于传统重要和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)、大蹼铃蜍(Bombina maxima)、黑斑蛙(pelophylax nigromaculata)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，已报道药理活性有光 谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。两栖类 皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药专利技术的热点。我国对两栖类药物的应用 有着悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中生物碱等有机小分子， 对其皮肤活性肽类物质研究不多。
技术实现思路
-本专利技术的目的在于提供一种林蛙抗菌肽，具有生物活性。 本专利技术的目的还在于提供一种林蛙抗菌肽的制备方法，适用于工业化生产。 本专利技术最终公开了在制备抗病毒药物中的应用，特别是该多肽在治疗病毒型流感、 乙型肝炎及艾滋病药物中的应用。本专利技术的林蛙抗菌肽，具有以下特征是一种碱性多肽，分子量范围在2-16KDa 之间，等电点为8.9-9.5;氨基酸组成为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸、 甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、Val、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯 丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸。其中碱性氨基酸占总量的23.99%，酸性氨基酸占总量的 19.08%。本专利技术的林蛙抗菌肽的制备方法是(1) 将林蛙干蛙皮，用pH4.0 0.2mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲溶液以料液比为l: 8~12 (m/v)的比例室温浸泡20 30h;将所得浸提液5000r.p.m离心30min，弃沉淀，留上清；(2) 将上清液煮沸5min，冷却，5000r.p.m离心30min，取上清过30KDa膜即得 抗菌肽滤液。根据凝胶层析法测定蛋白质的相对分子量的基本原理，选用V12 (MW1.3KDa)、胰岛素P链(MW3.3KDa)、胰岛素(MW5.7KDa)和细胞色素C (MW13KDa)和胰 蛋白酶抑制剂(MW2.01KDa)作为标准蛋白测定抗菌肽分子量范围。将抗菌肽酸水解，进行氨基酸组成分析，采用氨基酸测序仪进行测定。上述林蛙抗菌肽的抗病毒活性采用体外细胞实验法进行，实验结果表明本专利技术 的林蛙抗菌肽具有显著的抑制流感病毒、乙型肝炎病毒及艾滋病病毒，可用于制备治 疗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病治疗的药物。本专利技术的积极效果在于林蛙抗病毒抗菌肽是从天然资源得到的产物，具有很好 的抗病毒能力，同时还具有无溶血活性、无血浆凝固活性等优点，可用于制备抗病毒 型流感、乙型肝炎及艾滋病的药物。利用我国两栖类动物资源，为制备抗病毒型流感、 乙型肝炎及艾滋病药物提供了新的选择。附图说明图l:林蛙抗菌肽分子量分布范围图； 图2:林蛙抗菌肽氨基酸组成分析图。Tab. 1 The molecular weight of standard protein= 41.4ml_胰g白德抑制剂细胞色素C胰岛索胰岛繁B链V12MI, 20.1 13 5.7 3.3 1.3 , 4.304.11 3.76 3,52 3.11 Fe(ml) 4L470 165.2 195.8 248,6 _1.000_1.842 3.990 4.730 6.004根据公式lgl# —- " 一&丄式中M—分子量，KDa; Fe—洗膜体积，ml; Fff—外水体积，ml。以K/Fo为横坐标，/gM为纵坐标制作标准曲线，并计算出各组分分子量。 第一组分= 59.0ml Fe/Fo = 1.426， /gM= 4.201 根据标准曲线得MW=15.9KDa第五组分Fe = 218.3ml 7e/Ko = 5.272， /gM= 3.302 根据标准曲线得MW = 2KDa由以上结果可知，此林蛙抗菌肽分子量范围在2-16KDa之间。 Tab.2 The amino acid of antimicrobial peptide戮基;黢名称 氨蘂薩符号 氣蘂酸的含量(mg*ml")2.45354 3.57053 1.06521 1.89093 1.0144S3.25398 1.53978 3.16098 2.74865 1.498591.22 552 ■2.12-3 67 1.21877 1.36102 ■3-44993由上表可知，在抗菌肽氨基酸组成中，碱性氨基酸占氨基酸总量的23.99%， 酸性氨基酸氨基酸总量的19.08%。 具体实施方法-下面实施例用来进一步说明本专利技术，但本专利技术的内容并不局限于此。 实施例l:(一)林蛙抗菌肽的制备5天冬m酸 Asp谷敏酸 Glu 丝弒酸 Ser 组氣酸 His 精氣酸 Arg甘鎩酸 Gly苏银黢 Thr鱸鳜酸 Pro丙氣黢 Ala.缬银酸 锡甲硫鎩:酸 Me言.异亮M酸 lie亮缀騣 Leu色氨酸 Trp苯丙缀:黢 Phe赖缀黢 Lys半胱缀黢 C，(1) 称取20g的林蛙干蛙皮，用200ml pH4.0 0.2mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲溶液 浸泡24h。(2) 将所得浸提液5000r.p.m离心30min,弃沉淀，留上清。将上清液煮沸5min， 冷却，5000r.p.m离心30min，取上清过30KDa膜即得抗菌肽滤液。于4'C条件下保存备用o(3) 根据凝胶层析法测定蛋白质的相对分子量的基本原理，选用V12 (MW1.3KDa)、胰岛素P链(MW3.3KDa)、胰岛素(MW5.7KDa)和细胞色素C (MW13KDa)和胰蛋白酶抑制剂(MW2.01KDa)作为标准蛋白，与纯化 样品混合溶解后上SephadexG-25柱，测各组分洗脱体积。以Ve/VO为横坐标，lgM为 纵坐标制作标准曲线，并计算出各组分分子量(见附图l)。(4) 林蛙抗菌肽氨其酸组成分析将抗菌肽酸水解，进行氨基酸组成分析，采 用氨基酸自动分析仪进行测定(见附图2)。(二)林蛙抗菌肽抗病毒实验(1)林蛙抗菌肽抗流感病毒的实验在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行2倍倍比稀释，共6个稀释度， 每孔100vl，同时设置正常细胞对照，流感病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3X104个 C8166细胞和200TCIDs。的流感病毒，每孔的总体积为200vL。置37。C， 5°/￡02培养箱内培 养。感染后第二天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选 取5个不重叠的视野，计数流感病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞 体形成达50%时的药物浓度。EC50是对50y。宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治 疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。(2)林蛙抗菌肽抗乙型肝炎病毒的实验在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行2倍倍比稀释，共6个稀释度， 每孔100vl,同时设置正常细胞对照，乙型肝炎病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3X104 个C8166细胞和300TCIDs。的乙肝病毒，每孔的总体积为200vL。置37'C， 5%0)2培养箱内 培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种林蛙抗菌肽，具有以下特征：是一种碱性多肽，分子量范围在２－１６ＫＤａ之间，等电点为８．９－９．５；氨基酸组成为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、Ｖａｌ、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸；其中碱性氨基酸占总量的２３．９９％，酸性氨基酸占总量的１９．０８％。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：滕利荣，孟庆繁，逯家辉，安金双，李青山，周杰，田晓乐，高朝辉，王贞佐，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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