类毒素制备的新方法技术

本文描述了一种用氧化剂处理毒素而制备类毒素的方法。文内也阐述了按此方法制备抗百日咳疫苗的方法。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及类毒素的制备。更具体地说，本专利技术涉及一种化学灭活，特别是用过氧化氢灭活毒素，并由此制备非细胞的解毒疫苗的新方法。百日咳是一种由百日咳杆菌引起的传染病。通过免疫接种可有效地控制这一疾病的发病率。当前国家和世界卫生组织建议婴儿应进行免疫接种，以预防百日咳的发病和蔓延。三种类型的疫苗已用于抗百日咳杆菌的免疫接种。最为广泛使用的疫苗系由全部已不再存活的百日咳杆菌体组成。这种疫苗虽对预防疫病是有效的，但存在下列几个问题1)施用后引起局部红斑，2)疫苗的施用伴随着诱发高热、全身性烦躁和不适，3)据称在某些情况下可引起严重的神经病学后遗症。另一种疫苗是将百日咳组分制备成尿素浸出物的形式。这种制品大约在1969年至1974年期间使用过，但后来已从市场上消失了。在日本，正在使用的一种新的百日咳疫苗系从百日咳杆菌的培养物上清液中制得。这种物质包含所有的培养物上清液蛋白质，由于生物体培养的变异性，最终组成可能不尽相同。此外，使用戊二醛或甲醛作为灭活剂有时会产生易于回复成活性毒素的聚集物。人们认为这些醛导致了席夫碱的生成，后者是化学不稳定物质，因此使类毒素易于回复成活性毒素。用迄今为止所知的方法制备诸如破伤风、白喉、和霍乱毒素之类的其他毒素亦具有类似的弊端。因此，对于一种用来制备基本上无不良组分和效应的既安全又稳定的非细胞性毒素之改进方法的需求是十分明显的。因此，本专利技术的目的在于制备一种用化学方法对其毒素已不可逆地灭活的类毒素。本专利技术的另一目的是制备一种无内毒素或其他常易产生有害副作用的毒性物质之类杂质的百日咳疫苗。本专利技术的又一目的是提供一种保护易感宿主免遭百日咳侵袭的方法，该法系通过向所述宿主施用按照本专利技术所制备的致免疫量的抗原而达到上述的保护作用。随着以下对本专利技术的详细描述，本专利技术之其他目的和优点将是显而易见的。当结合附图阅读下述详细说明时，将能更好地理解本专利技术的上述和其他目的、特点以及许多附带的优点，其中图1表示用过氧化氢灭活百日咳毒素的动力学，在方法章节中所述的标准条件下，用过氧化氢处理百日咳毒素。按图中所指明的时间取出反应混合物(△，□，○)的试样，并用酶结合免疫吸附剂测定法分析其血细胞凝集活性(△，▲)，转导子腺苷二磷酸-核糖基化活性(□，■)和抗原活性(用ELISA测定法)(○，●)。对于用同样方法但不用过氧化氢处理的百日咳毒素也进行这些测试(▲，■，●)。通过添加过氧化氢酶使反应终止。图2是前类毒素和PTH-06类毒素的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，图中自左至右的线条(lanes)表明1-蛋白质标准物;2，3，4-PTH-06的两倍稀释液;5-蛋白质标准物;6，7，8-前类毒素的两倍稀释液;9-蛋白质标准物。图3表示百日咳类毒素的稳定性。用批号为PTH-04的吸附百日咳类毒素，以图中所示剂量对小鼠进行免疫接种。免疫接种所用的PTH-04是在两周内配制的(●，■)，在4℃下保存了6个月(○，□)，在免疫接种后2周(○，●)，和4周(□，■)，用酶结合免疫吸附剂测定法、CHO细胞抑制、和防御百日咳杆菌体对大脑内的侵袭来测定血清抗体。本专利技术的上述和其他目的系通过一种制备类毒素及其疫苗的方法而实现的，其中类毒素的具体制备方法如下用足以化学灭活其毒素，但保留其致免疫性质量的氧化剂处理至少部分提纯或分离的毒素，然后分离出完整的类毒素或其部分。此处所用的术语“氧化剂”意指能氧化肽链某些特定位置上之毒素的任何试剂，而在这些特定位置上产生半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸和/或酪氨酸之类的氨基酸残基。这类氧化剂可以是有机物或金属。较佳的氧化剂可列举如下过氧化氢、过氧化钠、N-氯-4-甲基-苯磺酰胺钠盐(氯胺-T)、过甲酸、过氧化二噁烷、过碘酸、高锰酸钠、次氯酸钠、以及该
中所熟知的其他类似物质。其中尤以过氧化氢为更佳，因其操作容易、价格低、且易于得到。除特别另行定义外，本文所用的全部科学或技术术语均具有如本专利技术所属
中普通熟练人员通常所理解的同样意义。以下引用的所有参考资料均列在文内，以供参考。虽然文内所述的类似或等同的方法和物质均可用于本专利技术的实施或文内所提到的试验，但以下将对较佳的方法和物质进行描述。本文所用的术语“基本上”提纯或分离系指毒素至少已被分离和/或提纯至这样一种程度，以至在类毒素施用到宿主中后无这类可能引起有害反应的微粒状或可溶性细菌污染物或杂质。应当注意，起始物质不必是提纯的细菌制剂。仅部分分离或提纯的制剂也可用于本文所述的方法。除用氧化剂处理外，此法的主要步骤与Sekura等在Journal of Biol.Chem.25814647-14651 1983中业已描述的方法相似(上述文献列于此处仅供参考)，以下将以百日咳毒素作为说明性例子进行概要描述。物料-Affi一凝胶蓝(100-200目)系从Biorad得到，溴化氰活化的琼脂糖4 B从Pharmacia购得，而由Spiro法制备的胎球蛋白则从Gibco得到。丝状血凝素和百日咳毒素来自Tohama菌株，以及对付这些蛋白质的抗体均按“Cowell et al.，Seminar in Infectious Diseases Vol.IVBacterial Vaccines，4371-379(1982)所述的方法制备。百日咳杆菌菌株系来自保存在“Pertussis Branch，Office of Biologics，Bethesda，MD.”中的收集品。该研究中所用的其他物料均为试剂级，并从普通供应厂商购得。胎球蛋白亲和树脂系按照制造厂商所推荐的方法将200毫克胎球蛋白与25克溴化氰活化的琼脂糖4 B相结合而予以制备。生物培养物-在37℃温度下，将冻干的百日咳杆菌敞开在Bordet-Gemgou血琼脂板上，并繁殖二代。然后使这两个板的生长物分别用来接种起始培养物[置于500毫升烧瓶中的200毫升Stainer-Scholte介质(Hewlett et al.，J.Bacteriol.127890-898，1976)]，并让其在37℃下培养过夜，同时加以搅拌。盛有1.3升Stainer-Scholte介质的Fernback烧瓶(2.8升)用起始培养物中的生长物接种，直至初始A650在0.05-0.1之间。接着在36℃温度下，使细菌在转速为120转/分的回转摇动器中培养约40至60小时，直至A650达到2.5-2.8。当然，细菌可在该
内熟知的其他条件下生长，而且容积可按需要适当进行调节。此外，也可使用其他的百日咳杆菌菌株。百日咳毒素的测定-可使用该
内熟知的几种方法来测定该毒素。对于提纯过程中所用的常规快速测定法，系按“Irons et al.，Biochim.Biophys.Acta 580175-185(1979)中所述的方法，用鹅的红细胞测定百日咳毒素的血细胞凝集活性。促进淋巴细胞增多的活性系按“Sato et al.，Infect.Immun.6899-904(1972)中所述的方法进行测定。注射后三天，血中白细胞比本底增加10，000白细胞/升时的物料量，定义为一个单位促进淋巴细胞增多的活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种类毒素的制备方法，它包括用一定量氧化剂处理至少部分分离的毒素，以对所说毒素进行化学灭活，但同时保留其致免疫性，此后从中获得灭活的毒素或其部分。

【技术特征摘要】
US 1986-6-16 874,637书的范围内。权利要求1.一种类毒素的制备方法，它包括用一定量氧化剂处理至少部分分离的毒素，以对所说毒素进行化学灭活，但同时保留其致免疫性，此后从中获得灭活的毒素或其部分。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说氧化剂能够在毒素钛链中特定位置上对毒素进行氧化，而在这些位置上产生选自由半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸和酪氨酸所组成的这一组中的氨基酸残基。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所说氧化剂选自由过氧化氢、过氧化钠、N-氯-4-甲基-苯磺酰胺钠盐(氯胺-T)、过甲酸、过氧化二恶烷、高磺酸、高锰酸钠、次氯酸钠、及其混合物所组成的组。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所说氧化剂是过氧化氢。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所说氧化剂是氯胺-T。6.根据权利要求1所述的方法，其特征是在微量金属存在下处理所说的毒素。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所说金属离子选自由亚铁、铁、钴和铬所组成的组。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗纳德，D塞库拉，
申请(专利权)人：罗纳德D塞库拉，
类型：发明
国别省市：US[美国]