还原甲硫氨酸亚砜残基的方法技术

本发明专利技术公开了一种将肽和蛋白质中的甲硫氨酸亚砜残基还原成甲硫氨酸残基的方法。该方法的特征在于：将所述的肽或蛋白质置于基本上无水的三氟乙酸反应介质中，该介质含有约０．１Ｍ至约３Ｍ的有机硫化物、约０．０１Ｍ至约３Ｍ的卤酸，所述的卤酸选自盐酸、氢溴酸和氢碘酸。（*该技术在2008年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
甲硫氨酸的亚砜氧化产物是自然界及合成肽化学中常见的衍生物。由于所述产物较易形成，使它成为通常存在于大多数由天然源分离出的含有甲硫氨酸的肽中的杂质。最为可取的是，采用经过提纯的肽，以避免易形成亚砜的贮藏条件〔Toennies，G.，和Callan，T.P.(1939)J.Biol.Chem.129，481〕。一经氧化，降低了的母体硫醚的亲核性使氨基酸变得对其他的改性不敏感。这是其应用于肽合成〔Iselin，B.(1961)Helv.Chim.Acta44，61〕和蛋白质改性研究〔Tashjian，A.Ontjes，D.，和Munson，P.L.(1964)Biochem.3，1175〕的基础。除了在合成时需要进行可逆保护外，一经提纯，甲硫氨酸的氧化倾向，使众多研究人员选用其他氨基酸代替之〔Kempe，T.Chow，F.，Peterson，S.M.，Baker，P.Hays，W.，Opperman，G.L′Italein，J.J.，Long，G.和Paulson，B.(1986)Biotechnology4，565;Krstenansky，J.L.，Trivedi，D.，Johnson，D.，和Hruby，V.(1986)J.Am.Chem.Soc.108，1696;Schalch，D.，Reisman，D.，Emler，C.，Humbel，R.Li，C.H.Peters，M.，和Lau，E.(1984)Endocrinology115，2490〕。对含有甲硫氨酸亚砜的肽进行选择性和非破坏性还原是肽化学中经常遇到的难题〔Kessler，W.，和Iselin，B(1966)Helv.Chim.Acta49，1330〕。最常用的方法是于高温下，采用高浓度的还原剂，例如二硫苏糖醇或β-巯基乙醇来完成还原作用〔Houghten，R.A.，和Li，C.H.(1979)Anal.Biochem.98，36〕。该反应的速度缓慢，整个过程通常产生不完全的还原。另一种可供选择的还原方法是分别在下述溶液中，用甲硫醚或苯硫基甲烷，促进氧交换。所述溶液是HCl水溶液〔Savige，W.E.，和Fontana，A.(1977)AdvinEnzymology47，453;Shechter，Y(1986)J.Boil.Chem.261，66〕，无水HF〔Tam.J.P.，Heath，W.F.，和Merrifield.R.B.(1983)J.Am.Chem.Soc.105，6442〕，1M的三氟甲磺酸-TFA〔Fujii，N.，Kuno，S.，Otaka，A.，Funakoshi，S.，Takagi，K.，和Yajami，H.(1985)Chem.Pharm.Bull.，Jpn.33，4587〕。在这些情况下，还原反应较易进行，并能保持不同程度的二硫化物的完整性。然而，值得注意的是，暴露在具有上述性质的一类强酸下可能产生的副作用。在相当一段时间里已认识到，卤酸可用来催化，将氧从亚砜上转移而成硫醚〔Scorrano.G.(1973)Acc.Chem.Res.6，132〕。Savige和Fontana(见上文)首先明确地描述了采用12NHCl和甲硫醚来还原游离的(即不是蛋白质部分)甲硫氨酸亚砜的方法;还介绍了该方法应用于氧化的溶菌酶衍生物的成功实例，其中所产生的副反应最小。他们得出结论“该反应的条件相当严格，需要采用高浓度的HCl。”最近，Shechter(见上文)报道，采用甲硫醚和不定浓度的HCl，对蛋白质中的甲硫氨酸亚砜进行类似的还原。他推断“当HCl的浓度为4.4-10.7M时，反应继续进行，直至完成;而当HCl的浓度较低(即1.0M)时，还原反应极大地减慢。”在上述两项研究中，均未对次要的改性进行高性能分析。一般认为，甲硫氨酸亚砜在无水HF或1M的三氟甲磺酸-TFA中发生还原的机理不同于其在HCl水溶液中进行还原的机理。据信，在这些无水强酸中，还原程度随着混合物的酸度而变化，并不依赖于酸性阴离子的亲核性。已报道的有效还原反应，使不希望有的改性降到了最低水平。然而，由于溶剂的苛性，要求特别处理的预防措施，这样，其用途就受到了严格的限制。本专利技术旨在提供一种简易且具有高度选择性的方法，用以处理含有甲硫氨酸亚砜残基的蛋白质和肽，以便有选择地将所述残基还原成甲硫氨酸残基。具体地说，本专利技术方法是采用比先有技术方法中采用的更为温和的反应条件，进行还原反应。因此，本专利技术的目的在于提供一种这样的方法，即对含有一个或多个甲硫氨酸亚砜残基的肽和蛋白质进行处理，以便将所述残基还原成甲硫氨酸残基。该方法包括将所述肽或蛋白质置于基本上无水的三氟乙酸反应介质中，所述反应介质含有约0.01M至约3M的有机硫化物、约0.01M至约3M的卤酸，所述卤酸选自盐酸、氢溴酸和氢碘酸。如上所述，本专利技术涉及一种选择性地将含有甲硫氨酸亚砜残基的蛋白质和肽还原成其含甲硫氨酸残基对应物的方法。该方法主要可用于从成熟的、具有生物活性的产物的氧化前体产生成熟的、具有生物活性的产物。所述氧化前体常常是由于合成产生蛋白质或肽时所采用的条件而形成的。在任一反应步骤的过程中，包括对希望得到的蛋白质或肽进行合成和提纯的过程，使用甲硫氨酸残基氧化成亚砜形式的条件是会出现的。如果没有可行的方法，用于将甲硫氨酸残基恢复成其还原态，就很难获得大量具有适当尺寸的理想产物，至少在大规模生产成熟产物时是如此。本专利技术的方法于溶剂三氟乙酸中实施。虽然不是绝对必需的，但最好在基本无水的条件下实施本专利技术方法，因此要采用基本上无水的三氟乙酸。采用“基本上无水的”三氟乙酸，并不意味着需要采取切实的措施，以排除存在的微量水份，而仅意味着应避免加水。将待还原的蛋白质或肽与有机硫化物和卤酸一起加到三氟乙酸中。可按任何次序加入所述试剂。但较理想的是，先将蛋白质或肽溶解于三氟乙酸中，此后，加入有机硫化物，接着加入卤酸。加到三氟乙酸中的蛋白质或肽的量一般应使浓度达到约0.01mg至约100mg/ml，较理想的是约0.1mg至约20mg/ml，更理想的是约1mg至约10mg/ml。在三氟乙酸中，使蛋白质或肽同有机硫化物和某种卤酸反应。除了活性硫醚部分外，可采用众多的有机硫化物，唯一的要求是这些有机硫化物在本专利技术方法的条件下应该是惰性的。典型的硫醚的实例包括甲硫醚、乙硫醚、乙基甲基硫醚、苯硫醚、二硫苏糖醇、半胱氨酸等。优选的硫醚是二烷基硫醚，其中每个烷基基团含1至3个碳原子。本专利技术方法中采用的最优选硫醚是甲硫醚。将有机硫化物加到反应混合物中，以产生约0.01M至约3M的浓度。较理想的浓度为约0.1M至约1M，更理想的浓度为约0.5M至约1M。其余的必需试剂是卤酸。卤酸选自盐酸、氢溴酸、氢碘酸。较好的卤酸是盐酸。反应混合物中卤酸的含量一般为约0.01M至约3M。较理想的是，卤酸含量为约0.1M至约1M。在上述含量范围内，若被处理的蛋白质或肽含一个或多个二硫键，则最好在所述范围的下限实施本专利技术的方法;若不存在二硫化物，则可在所述范围的上限实施本专利技术的方法。虽然，如上所述，最好在无水条件下实施所述方法，但由于加入了卤酸，通常会在反应混合物中掺入一定量的水份。因为所用卤酸的总量很少，并且它可通过以高浓度酸形式而掺入，所以，实际上仅本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种处理含有一种或多种甲硫氨酸亚砜残基的肽和蛋白质以便将所述残基还原成甲硫氨酸残基的方法，该方法包括：使所述的肽或蛋白质置于基本上无水的三氟乙酸反应介质中，所述介质含有约０．０１Ｍ至约３Ｍ的有机硫化物、约０．０１Ｍ至约３Ｍ的卤酸，所述卤酸选自盐酸、氢溴酸和氢碘酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：理查德丹尼斯迪马奇，哈伦比尔朗，
申请(专利权)人：伊莱利利公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]