载脂蛋白A1,A2高压液相色谱仪分离法制造技术

一种载脂蛋白Ａ－［１］、Ａ－［２］高压液相色谱仪分离法，是利用ＡＰＯＡ－［１］、ＡＰＯＡ－［２］热凝固点大于血清其它蛋白的特点，使用加热法沉淀其它蛋白，其上清液直接进样，一次即可分离出ＡＰＯＡ－［１］、ＡＰＯＡ－［２］，其操作步骤是将血清放入沸水中加热，取其经离心、过渡的上清液与洗脱液充分混合后，直接注入高压液相色谱仪，全部过程约在３０分钟内完成，便于在临床实验室推广及其制备。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种液相色谱仪分离物质的方法，是医学界用于载脂蛋白A1、A2(APOA1、APOA2)的高压液相色谱仪(HPLC)分离方法。近年来，各国医学界对载脂蛋白的研究十分活跃，因为它影响到脂蛋白的合成、分泌和代谢，其测定、分离又对冠心病的预防、诊断和治疗，具有重要的临床价值，所以正受到人们的高度重视和关注。自一九八三年日本学者首次提出使用高压液相色谱仪分离载脂蛋白以来，迄今为止用该法测定APOA1、APOA2均采用连续漂浮超速离心法，即将经过多次超速离心(转速在5万转/分以上)的血清HDL上清液进行过滤后，再与洗脱液充分混合，在60℃温度下加热5分钟，而后注入高压液相色谱仪，分离出APOA1、APOA2，但目前这种测定方法仍停留在研究室中未能全面推广，其主要原因是血清在进入高压液相分析柱前必须先由超速离心机分离为HDL、LDL、VLDL，再分别这样，这一步骤需要仪器昂贵(仅超速离心机的价格就为5万美元/台)，耗时长(54-72小时)，手续复杂，又因血清离心后的上清液与沉淀物液相界面不清晰，故脂蛋白提取不完全，这对测定精度有一定的影响本专利技术的目的在于利用APOA1、APOA2热凝固点高于血清中其它蛋白的温度差，建立一种采用加热法沉淀其它蛋白，经普通离心后的上清液直接进样，一次即可分离APOA1、APOA2的HPLC分离法。本专利技术将比原连续漂浮超速离心法对其它蛋白沉淀更加完全，测定精度更高，由于简化了操作手续，故采用普通离心即可完成进一步的分离，且测定时间短，投资费用低。本专利技术是这样实现的将装在密封试管中的血清标本，首先在沸水中加热，取其经离心、过滤的上清液与洗脱液充分混合后，直接注入HPLC，一次分离APOA1、APOA2，洗脱液由0.05MNa2SO4、0.02MNaH2PO4、0.1%S.D.S(十二烷基磺酸钠)、0.05%NaN3组成，其PH＝6.8。本专利技术使用的仪器1、高压液相柱包括BiO-Sil TSK予柱75×7.5mm，Bil-Sil TSK250凝胶分离柱300×7.5mm，Bil-Sil TSK400凝胶分离柱300×7.5mm，上述三柱连接使用。2、高压液相仪高压液相泵资料处理仪、分光光度仪、离心机。试剂与标准用于凝胶分离柱分子量试剂为纯APOA1标准品、纯APOA2标准品。操作步骤血清在沸水中(100℃)加热5分钟，然后经4000转(11600g)离心10分钟，其上清液经0.22mm过滤片过滤后与洗脱液充分混合，直接注入分离柱，过柱后使用紫外可见光检测器，波长(A)280mm，流速1-2ml/分，用纯APOA1、APOA2标准品作外标定量。 附图说明图1、对数分子量和保留时间曲线图2、纯APOA1、APOA2高压液相图谱图3、HDL高压液相图谱图4、血清加热100℃、5分钟，上清液高压液相图谱图5、APOA1加入量和测得浓度相关关系图。图6、APOA2加入量和实测浓度相关关系图。APOA1、APOA2波峰的确认在分离APOA1、APOA2相同条件下，利用分子量标准品以对数分子量为纵坐标，保留时间为横坐标，标出两者线性关系图(如图1曲线所示)，现将将图1中的标号分述如下(表一)表一标号 分子量 对数分子量 保留时间(道尔顿) (分)A1(甲状腺球蛋白) 670000 5.826 11.491A2(r-球蛋白) 158000 5.198 15.081A3牛白蛋白 44000 4.68 17.475A4肌球蛋白 17000 4.23 19.441A5VitB121350 3.13 27.608XlAPOA128000 4.45 17.95X2APOA217000 4.23 19.44APOA1标准分子量为28000(道尔顿)、APOA2标准分子量为17000(道尔顿)，该两物质在上述液相条件下理论出峰时间(保留时间)应分别为18分钟和20分钟左右。对比法分别对纯APOA1、APOA2的高压液相图谱(图2)、HDL高压液相图谱(图3)、血清APOA1、APOA2高压液相图谱(图4)进行对照，其图形相似，且保留时间均为18和20分钟左右。(见表二)表二保留时间(出峰时间)图谱名称 APOA1APOA2纯APOA1、APOA218.138分 20.168分高压液相图谱HDL高压液相图谱 18.837分 20.170分血清加热100℃5分钟上清液APOA1、 18.064分 20.410分APOA2高压液相图谱免疫扩散法用血清经本专利技术分离法在高压液相色谱仪中保留时间为18分钟和20分钟时的提取液，经浓缩滴入RIM APOA免疫扩散药盒后，它们均呈阳性反应，18分钟时提取液在RIM APOA1免疫扩散药盒中呈阳性反应，20分钟时提取液在RIM APOA1免疫扩散药盒中呈阴性反应。该免疫扩散法可证明在18分钟和20分钟保留时间的提取液中均存在APOA成份，其中18分钟提取液为APOA1，而20分钟提取液中可能是APOA2。回吸收率试验(1)、分别在三个试管中各加入血清A IML，第一管中加入洗脱液150μL，第二管加入APOA1(200μg/dI)150μL，第三管中加入APOA2(100μg/dI)150μL，100℃加热5分钟后进样，其结果见纯APOA1、APOA2标准试剂回收率表格(表三)。表三APOA1μg/dI APOA2μg/dI实际值 预期值 回吸收率 实际值 预期值 回吸收率血清AIML+洗脱液150 173.29 91.31μL血清AIML+APOA1207、87199.37 104.26%(200μg/dI)×150μL血清AIML+APOA2(100μg/dI) 105.45 104.36 101.07%×150μL其APOA1的回吸收率为104.26%，APOA2的回吸收率为101.04%。(2)用任一血清B的APOA1、APOA2作为“标准血清”，并以各种比例加入另一血清C，其测定结果见血清B加入各种比例血清C回收率表格(表四)。 如按表四数值将APOA1、APOA2加入量为纵轴，实际测得APOA1、APOA2浓度为横轴，可以画出两条相关曲线，APOA1曲线r＝0.999，y＝70.03+0.766x(图5)，APOA2曲线r＝0.991，y＝30.88+0.691x(图6)。精密度试验同一份样品分成10管同样处理和进样，APOA1的结果为192.1±1.68μg/dL，变异系数为0.88%，APOA2结果为93.4±1.52μg/dL，变异系数为1.63%(见表五)。表五试管序号 APOA1mg/dL APOA1mg/dL1 191.2 92.32 190.6 92.83 190.7 91.64 191.4 91.25 191.2 93.06 192.0 93.87 191.3 93.38 192.7 94.59 195.4 95.410 194.8 95.8 试管序号 APOA1mg/dL APOA2mg/dL结果 192.1 93.4误差 ±1.68 ±1.52变异系数 0.88% 1.63%用高压液相色谱仪分离血清载脂蛋白必须解决二个问题一是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种载脂蛋白Ａ↓［１］、Ａ↓［２］高压液相色谱仪分离法，其特征在于将装在密封试管中的血清标本，首先在沸水中加热，取其经离心、过滤的上清液与洗脱液充分混合后，直接注入高压液相色谱仪，一次分离ＡＰＯＡ↓［１］、ＡＰＯＡ↓［２］，洗脱液由０．０５ＭＮａ↓［２］ＳＯ↓［４］０．０２ＭＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］、０．１％Ｓ．Ｄ．Ｓ（十二烷基磺酸钠）、０．０５％ＮａＮ↓［３］组成，其ＰＨ＝６．８。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邹雄，
申请(专利权)人：山东医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]