稳定的冷适应的温度敏感性嵌合肠道病毒的开发制造技术

本发明专利技术涉及嵌合病毒毒株，特别是稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株EV71:eTLLβP20和EV71:TLLeC5以及稳定的嵌合肠道病毒毒株TLLeCA16。本发明专利技术还涉及包含这些毒株的核苷酸序列的载体和包含这些毒株的疫苗。

Stable cold adapted temperature sensitive chimeric enteroviruses were developed

The present invention relates to chimeric virus strains, in particular to stable, cold adapted, temperature sensitive enterovirus 71 strains EV71:eTLL beta P20 and EV71:TLLeC5, and stable chimeric enterovirus strain TLLeCA16. The present invention also relates to vectors comprising nucleotide sequences of these strains and vaccines comprising these strains.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定的冷适应的温度敏感性嵌合肠道病毒的开发相关申请的交叉引用本申请涉及2014年6月12日提交的美国临时专利申请系列号62/011,406，并要求其优先权。该申请援引加入本文。序列提交本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表题为2577236PCTSequenceListing.txt，2015年4月23日创建，并且大小为62kb。电子格式的序列表的信息整体援引加入本文。专利技术背景本专利技术涉及嵌合病毒毒株，特别是稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株EV71:eTLLβP20和EV71:TLLeC5以及稳定的嵌合肠道病毒毒株TLLeCA16。本专利技术还涉及包含这些毒株的核苷酸序列的载体和包含这些毒株的疫苗。本文中用来说明本专利技术的背景或提供关于实践的额外细节的出版物和其他材料援引加入本文，并且为了方便，分别分组在参考文献中。手足口病(HFMD)是发热性疾病复合体，其特征在于手和脚的手掌和脚掌上的皮肤疹(皮疹)，同时发生影响口的皮肤粘膜水疱溃疡性损伤(粘膜疹)。该疾病是由许多肠道病毒引起的，柯萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)为主要病原体(1)。除了HFMD，EV71与一系列其他临床疾病有关，包括非特异性发热性疾病、急性幼儿呼吸道感染、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样急性弛缓性麻痹(1-3)。如其他肠道病毒，EV71和CA16是直径28-30nm的小无包膜病毒。病毒衣壳是二十面体对称的，并且由60个相同的单元(原体)组成，每个单元由一个拷贝的4个病毒结构蛋白VP1-VP4组成。衣壳围绕约7,450个核苷酸(nt)的单链正义RNA基因组的核心。病毒基因组由单开放阅读框组成，其编码约2200个氨基酸的多聚蛋白，并且在其5’端侧面为约750nt的长非翻译区，在其3’端侧面为约85nt的短非翻译区，在其3’末端具有可变长度的poly-A段(tract)。人肠道病毒71(HEV71)被归类为小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)内的肠道病毒属(Enterovirus)下的人肠道病毒A(HumanEnterovirusA)物种(2、3)。基于其主要衣壳蛋白(VP1)基因的系统发育分析，EV71分为3个主要基因群(genogroup)(A、B和C)，并且基因群B和C分别进一步细分为基因型B1-B5和C1-C5(4)。在最近15年中，EV71的活性和毒力增加，特别是在亚太地区内，引起HFMD的严重爆发并影响中枢神经系统，具有神经后遗症和死亡，特别是在幼儿中。目前，没有用于治疗由于EV71的疾病的特异性抗病毒药物，也没有用于控制和预防感染的任何有效疫苗。减毒活口服和灭活亲代脊髓灰质炎病毒疫苗在预防脊髓灰质炎中的成功表明通过免疫接种预防由于EV71的疾病的潜力(28)。已报道许多以前开发EV71疫苗的尝试，并且一些已达到临床试验的各种阶段(29-49)。但是，对控制和防止HFMD爆发的有效疫苗需要解决几个挑战(50-52)。首先，HFMD是由许多肠道病毒引起的，EV71和CA16为主要病原体，特别是在爆发情况下(5-27)。最近公开的Chou等人(2012)的研究已证实针对EV71引起的抗体不会针对CA16感染交叉保护，反之亦然(50)。高度需要靶向EV71和CA16的多价疫苗以防止由于这两种主要病原体的HFMD爆发。第二，据发现EV71在最近15年中快速进化，并且已知一种以上的EV71基因型共循环并引起世界各地的爆发。已发现感染特异性基因型之后各种基因型之间的交叉保护免疫是非均质的，并且候选EV71疫苗需要解决这个问题以提供针对所有已知循环基因型的交叉保护。最近已开发EV71的稳定的冷适应的温度敏感性减毒毒株EV71:TLLβP20。参见2013年1月18日提交的国际申请号PCT/SG2013/000027，其整体援引加入本文。病毒不会在39.5℃的温度(人体高热温度)下温育的培养细胞中复制，甚至当用高感染复数(m.o.i)的病毒接种物接种培养细胞时也是如此。EV71:TLLβP20在确定的培养条件下是表型和遗传稳定的。通过温度回复研究中的多个世代确定稳定性。最近已在猴的研究中证实这种潜在的候选EV71疫苗的安全性、免疫原性和有效性(中和抗体)。但是，猴研究中EV71:TLLβP20诱导的中和抗体表现出针对相似基因群内的EV71基因型的高中和抗体滴度，但是针对属于不同基因群的基因型具有低中和滴度。该发现证实以前公开的在日本国立传染病研究所(NIID)进行的猴研究的发现，其显示一种基因型诱导的中和抗体赋予针对同源基因群的EV71毒株的高中和抗体滴度，但是具有较低的针对属于异源基因群的毒株的中和滴度(32)。因此，需要开发嵌合病毒毒株，其可用于开发针对由于EV71和/或CA16的HFMD的疫苗。专利技术概述本专利技术涉及嵌合病毒毒株，特别是稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株EV71:eTLLβP20和EV71:TLLeC5以及稳定的嵌合肠道病毒毒株TLLeCA16，以及它们的灭活形式。本专利技术还涉及包含这些毒株的核苷酸序列的载体和包含这些毒株的疫苗。因此，在一方面，本专利技术提供稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株和稳定的嵌合肠道病毒毒株，以及它们的灭活形式。在一实施方案中，稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株是如本文所述的EV71:eTLLβP20。在另一实施方案中，稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株是如本文所述的EV71:TLLeC5，其携带EV71基因型C5的衣壳蛋白。在一额外的实施方案中，稳定的嵌合肠道病毒毒株是如本文所述的TLLeCA16，其携带CA16的衣壳蛋白。在第二方面，本专利技术提供一种组合物，其包含本文所述的肠道病毒71毒株和嵌合肠道病毒毒株中的一种或多种，单独或与国际申请号PCT/SG2013/000027中描述的亲代稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株EVL:TLLβP20组合。如这个上下文中所用，“单独”表示所述组合物包含病毒毒株EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16中的一种或多种。还如这个上下文中所用，“与…组合”表示所述组合物包含病毒毒株EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16中的一种或多种以及亲代EV71:eTLLβP20。在一实施方案中，所述组合物包含有效量的一种或多种本文所述的病毒毒株，单独或与亲代EVL:TLLβP20组合。在一些实施方案中，一种、一些或所有毒株可以是病毒毒株的灭活形式。在另一实施方案中，所述组合物包含一种或多种生理或药学可接受的载体。在另一实施方案中，所述组合物为疫苗。利用技术人员公知的技术制备包含一种或多种本文所述的病毒毒株(单独或与亲代EVL:TLLβP20组合)的疫苗。如这个上下文中所用，“单独”表示所述疫苗包含病毒毒株EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16中的一种或多种。还如这个上下文中所用，“与…组合”表示所述疫苗包含病毒毒株EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16中的一种或多种以及亲代EV71:eTLLβP20。在一实施方案中，所述疫苗包含活毒株。在另一实施方案中，所述活毒株是减毒的。在一额外的实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种冷适应的温度敏感性病毒毒株。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.12 US 62/011,4061.一种冷适应的温度敏感性病毒毒株。2.权利要求1的冷适应的温度敏感性病毒毒株，其中所述毒株为EV71:eTLLβP20。3.权利要求1的冷适应的温度敏感性病毒毒株，其中所述毒株为EV71:TLLeC5。4.权利要求1的冷适应的温度敏感性病毒毒株，其中所述毒株为TLLeCA16。5.一种组合物，其包含一种或多种权利要求1-3中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株。6.权利要求5的组合物，其进一步包含冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株EV71:TLLβP20。7.权利要求5或6的组合物，其进一步包含药学可接受的载体。8.权利要求5、6或7的组合物，其进一步包含佐剂。9.权利要求5-8中任一项的组合物，其为疫苗。10.权利要求9的组合物，其中所述疫苗是口服减毒活疫苗。11.权利要求9的组合物，其中所述疫苗是灭活疫苗。12.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或权利要求5-11中任一项的组合物，用于在个体中引发保护性免疫应答。13.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或权利要求5-11中任一项的组合物，用于预防个体患上肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒A16相关疾病。14.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或权利要求5-11中任一项的组合物，用于延迟肠道病毒71感染的个体和/或柯萨奇病毒A16感染的个体中肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒A16相关疾病的发作或者减缓其速度。15.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，或者权利要求5-11中任一项的组合物在制备在个体中引发保护性免疫应答的药物中的用途。16.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，或者权利要求5-11中任一项的组合物在制备预防个体患上肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒A16相关疾病的药物中的用途。17.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，或者权利要求5-11中任一项的组合物在制备延迟肠道病毒71感染的个体和/或柯萨奇病毒A16感染的个体中肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒A16相关疾病的发作或者减缓其速度的药物中的用途。18.一种在个体中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括给所述个体施用预防、治疗或免疫有效量的权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，或者权利要求5-11中任一项的组合物。19.权利要求18的方法，其中所述个体已暴露于野生型肠道病毒71和/或柯萨奇病毒A...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·B·蔡，
申请(专利权)人：淡马锡生命科学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG