降钙素类似物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及降钙素类似物多肽及其应用。所说多肽具有的氨基酸序列是用高丝氨基酸残基（Ｈｓｅ.ＮＨ↓［２］）替代了天然鳗鲡降钙素末端的脯氨酸酰胺残基（Ｐｒｏ－ＮＨ↓［２］）。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及降钙素类似物多肽及其应用。本专利技术的多肽可用于防止和/或治疗钙代谢性疾病，例如减轻骨质疏松症的疼痛，防止骨形成不全骨质疏松症的骨折，治疗高钙血和Paget氏病。降钙素作为一种肽激素由D.H.Copp等人于1961年在颈静脉血中首次发现，它显示出了降低血钙浓度的活性。现在已经由具有如下所示序列(实质上相应于SEQ IDNO1)的32个氨基酸残基构建了降钙素5 10 15Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-20 25 30Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro·NH2在上列氨基酸序列中，Pro.NH2表示脯氨酸酰胺残基，第1和第7位上的两个Cys残基由一个二硫键相连。此后，具有类似于降钙素生物活性的肽激素已由多种动物如鲑、鳗鲡、鸡、猪、大鼠、兔、羊、牛和Stingray中提取出来，这类天然降钙素的氨基酸序列已被测定。降钙素的结构特点包括32个氨基酸的恒定链长，第1和第7位半胱氨酸残基间的二硫桥，在N末端由7个氨基酸残基形成的环，以及羧基末端的脯氨酸酰胺。然而，普遍存在于所有降钙素中的氨基酸残基仅是第1、第4—7、第28和第32位的氨基酸(共7个)。据认为，普遍存在于所有降钙素(末端的脯氨酸酰胺是展现其生物活性所必不可少的〔J.T.Potts，Jr.et al.，“Calcium，ParathyroidHormone and the Calcitonins”，page 121 printed byExcerpta Medica，Amsterdam(1971)P.Sieber，“Calcitonin1969”，page 28，Proc.2nd Symp.，printed by MedicalBooks，London(1970)；and W.Rittel et al.，“Experientia”，Vo.，32，page＝246(1976)〕。已经知道降钙素显出降低血钙浓度〔P.F.Hirsch et al.，“Science”，Vol，146，page 412(1063)〕、抑制进食〔W.J.Freed etal.，“Science”，Vol.206，page 850(1979)〕和抑制胃分泌〔R.D.Hesch et al.，“Horm.Metab.Res.”，Vol.3，page 140(1971)〕的生物活性。为了获得降钙素，首先尝试了从哺乳动物血及组织样品中提取，然后才应用化学合成法。前者的局限性来自原材料的可得性和纯化操作过程的麻烦；而后者也有合成操作麻烦的不足，因为所有的降钙素都由32个氨基酸残基构成，合成本身及纯化过程又需要较长的时间周期，以致于以合理的代价提供大量的降钙素是极其困难的。近年来，遗传工程有了显著的发展，并已提出了遗传工程中的加工应用技术，包括以下步骤用DNA合成仪和单链cDNA合成编码降钙素之一的单链DNA片段；由单链cDAN制备双链DAN片段；纯化双链DNA片段；将纯化的双链DAN片段插入载体；用重组载体转化E.coli；培养转化体以表达编码降钙素的多肽；分离纯化所表达的多肽。然而，在这种情况下，具有C末端脯氨酸酰胺并表现出所需生物活性的多肽并不能由E.coli表达。因此，在分离一纯化步骤中需要进行C末端酰胺化处理，而C末端酰胺化酶非常昂贵，该酶学处理过程需要专门的技术和技巧，并且酶学过程致使目的产物的得率低。因此，考虑到试剂的成本及产物的得率，不能认为上述常规方法是一种适于工业规模生产降钙素的方法。于是，受让人公司的研究人员努力地研究并调查了加工利用遗传重组技术，以发现勿需昂贵C末端酰胺化酶的各种降钙素类似物，每一种类似物在其氨基酸序列中不含有甲硫氨酸(Met)，C末端结构为脯氨酸33—高丝氨酸3酰胺(Pro32—Hse33—NH2)，低级烷基，1—20碳原子，高丝氨酸33酰胺，或者可任意选择的多肽链及在C末端含有高丝氨酸酰胺〔Jap.Pat.Hei4(A.D.1992)—59795(A)，相应于EP464549〕。在这些专利文献中所描述的方法有些类似于受让人公司对作为肽激素之一的胃动素类似物所提出的方法，公开于Jap.Pat.Hei3(A.D.1991)—80096(A)(相应于EP355720)。也就是说，根据上述专利文献所描述的方法，每一种降钙素的制备可以是合成单链DNA片段，该片段包括N末端的前导多肽及其C末端的Met残基，编码降钙素类似物基因的多肽及其C末端Met残基，在C末端有Met残基的间隔肽，编码降钙素类似物基因且在其C末端有Met残基的多肽(间隔肽与降钙素类似物基因以复数形式排列)；合成互补于第一条单链DNA片段的单链DNA片段；由单链DNA片段制备双链DNA片段；将双链DNA片段插入载体(如质粒)得到重组载体；用重组载体转化微生物(如E.coli)或哺乳动物细胞(如CHO细胞)；培养转化体以表达在转化体中作为包涵体或融合蛋白的多肽；用溴化氰处理包涵体以断裂每一位置上的Met，并将C末端的Met残基修饰为Hse或Hse—内酯残基；用酸处理反应液，例如，用0.1N HCl溶液于30℃处理3小时，将所有的多肽转变成在其C末端带有Hse—内酯的那种形式；冻干所得多肽；然后用氨处理，或与低级烷基胺反应。在所说专利文献中公开的方法使得可能以合理的成本大量地制备各种降钙素类似物，但这些类似物的生物活性，如鲑I降钙素—Hse33—NH2基本上与天然鲑J降钙素的相同。本专利技术的目的之一是提供一种降钙素类似物，它有如所说专利文献中的极佳产率，同时显示出较其基本天然型降钙素明显高的生物活性。本专利技术另一个很重要的目的是提供防止和/或治疗钙代谢性疾病的药物组合物，它含有作为有效成分的降钙素类似物。本专利技术人通过努力的研究发现，尽管普遍存在于所有天然降钙素中的C末端Pro—NH2结构被认为是展示降钙素生物活性所必需的，但用Hse32—NH2替代C末端的Pro32—NH2能显著地增强其生物活性，因此本专利技术是成立的。因此，根据本专利技术，降钙素类似物的特征在于其氨基酸序列为(实质上相应于SEQ ID No2)5 10 15Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-20 25 30Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Hse·NH2在上列氨基酸序列中，Hse·NH2表示高丝氨酸酰胺，1位和7位上的Cys残基由二硫键相连。该氨基酸序列与鳗鲡降钙素的相同，但除了后者的C末端的氨基酸残基为Pro·NH2。用于防止和/或治疗钙代谢性疾病的本专利技术药物组合物的特征在于含有作为有效成分的降钙素类似物，该类似物具有所说的氨基酸序列。本专利技术的降钙素类似物的制备是通过用肽合成仪合成编码所说氨基酸序列但在32位有Hse残基的多肽，用铁氰化钾氧化1位和7位Cys中的硫羟基形成两Cys之间的二硫连接，用酸处理多肽形成C末端有Hse—内酯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有下列氨基酸序列（实质上相应于ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）的降钙素类似物：５ １０ １５Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－２０ ２５ ３０ Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｈｓｅ.ＮＨ↓［２］其中，Ｈｓｅ.ＮＨ↓［２］表示高丝氨酸酰胺，１位和７位Ｃｙｓ残基由二硫键相连。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：野田伦，吉名重亮，石田力，富谷升，
申请(专利权)人：株式会社三和化学研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]