分析物的提取、衍生化和定量制造技术

本发明专利技术提供了用于确定测试样品中一种或多种分析物的存在的方法，用于执行本文所述方法的材料，以及包含可用于实施本文所述方法的反应试剂的试剂盒。

Extraction, derivatization, and quantification of analytes

The present invention provides a method for determining the existence of a test sample of one or more analytes, for carrying out the methods of this material, and contains a reagent kit that can be used for implementing the method of this paper.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分析物的提取、衍生化和定量本申请根据U.S.C.§119(e)要求2014年5月30日提交的美国临时申请62/005,676的优先权，其全部内容被明确纳入本文作为参考。需要获得快速，流水线化且自动化检测特定分析物的方法。在医学环境中，这样的方法将促进诸如药物、激素、信号传导试剂和氨基酸等分析物的检测。在农业和公众健康的情况下，抗生素、杀虫剂或其它污染物的残留水平的检测也是我们食用的食物和饮用的水的安全性中不可或缺的部分。此外，近来食品标签标准的变化，例如"无激素"或"有机"也导致了农业领域中流线测试的需要。儿茶酚胺是维持人体健康状态重要的必需激素或神经递质。神经疾病(例如帕金森氏病或阿尔茨海默病)常常改变血液中这些物质的水平。变肾上腺素类(儿茶酚胺的衍生物)水平升高可指示某些癌症，例如嗜铬细胞瘤的发生。类似地，变肾上腺素类(变肾上腺素和去甲变肾上腺素(normetanephrine))，甲状腺激素(甲状腺素T4，3,5,5'-三碘甲腺原氨酸T3，和3,3',5-三碘甲腺原氨酸rT3)，雌激素(雌酮、固醇、雌二醇和雌三醇)，δ-9-四氢大麻酚(THC)，其衍生物和代谢产物等，是对于临床医师确定患者状态来说重要的许多其他生物学有意义的分析标记物。传统上，经由放射免疫分析(RIA)来进行儿茶酚胺的临床定量。近年来，由于质谱领域的技术进步，测试平台从RIA逐渐转移至液相色谱质谱(LCMS)。通常，基于LCMS的分析可提供快速、灵敏、分析物特异性读数，这些是RIA分析可能缺少的。然而，儿茶酚胺是难以检测的，因为它们易于被氧化降解。此外，现有技术儿茶酚胺/变肾上腺素的定量常常涉及复杂且繁琐的提取过程，提取回收率不稳定，从而导致结果往往是不可靠的，并且具有高的定量下限(LLOQ)；例如LLOQ＞10ng/mL。而且，现有的提取过程不能提供可靠的样品用于衍生化。药物包括非法和合法药物及其代谢物或衍生物。检测这些化合物对于法医或处方顺应性是非常重要的。此外，这些药物可能在体液中不稳定，因此检测可能困难。在任何情况下，非常需要一种完全自动化和简化的检测/定量方法，该方法能使人为介入或误差的空间最小。专利技术概述本专利技术提供了可用于测量生物样品中的儿茶酚胺(多巴胺，肾上腺素，去甲肾上腺素)，变肾上腺素类(变肾上腺素和去甲变肾上腺素)，甲状腺激素(T4，T3和rT3)，雌激素(雌酮，雌二醇，雌三醇)，大麻素如δ-9-四氢大麻酚(THC)，5-羟色胺，氨基酸，BPA以及许多其它含伯胺和仲胺、或者含酚的分子的水平的材料和方法。所需分析物可以通过质谱(包括串联质谱技术)选择性地、灵敏地检测和测量。整个定量过程包括样品的制备过程，采用固相提取以捕获分析物，然后进行分析物的化学衍生化，然后通过LC-MS/MS技术定量，如本文所述。在该工作期间发现，固相提取与Fmoc氯化物的化学衍生化和LC-MS/MS的组合提供血浆/血清样品中10pg/ml或更低的儿茶酚胺水平的分析物特异性、灵敏、准确、稳定且稳健的测量。定量变肾上腺素类和甲状腺激素的方法也被开发成具有相似的灵敏度和准确性。敏感和准确地测量这些分析物在临床环境相关的水平是有用的，特别是在低皮克/毫升的范围内，在小样本大小(100μl或更少的血浆/血清样品)，用易于配置成自动化的简单方法，且具有分析物特异性结果，而不会产生在其它分析技术，例如放射免疫测定法(RIA)中常见的任何分析物交叉。附图的简要说明图1A和1B呈现了实施例数据，显示内标当量100pg(图1A)和儿茶酚胺掺杂的血浆(图1B)的色谱图。图2A和2B显示了在10和100pg/ml每种儿茶酚胺获得的数据。图3提供了变肾上腺素类的色谱图：顶部是变肾上腺素(659.210/268.400)，中间是去甲变肾上腺素(645.100/166.100)，下方是变肾上腺素(659.210/268.400)。图4A,4B,4C,4D和4E显示了变肾上腺素和去甲变肾上腺素中各种位移的图谱。图5A,5B,5C和5D显示了甲状腺激素每个位移的各个峰：具有5ng/ml当量的血浆(图5A)，血浆空白(图5B)，血浆1ng/ml(图5C)以及含1ng/ml的200μLBSA(图5D)。图6A,6B和6C显示了甲状腺激素T3在31.3pg/ml(图6A)，rT3在31.3pg/mL(图6B)，T4在31.3pg/ml(图6C)各自的数据。图7A,7B和7C提供了尿中11–去甲-9-羧基-δ-9-四氢大麻酚的定量的线性数据；1,000pg/ml(图7A),100pg/ml(图7B),10pg/ml(图7C)。图8A和8B提供了尿中11–去甲-9-羧基-δ-9-四氢大麻酚的定量的回收数据：回收-1,000pg/rxn标准品(图8A)，回收1,000pg/rxn提取的峰(图8B)。专利技术详述本专利技术的方法涉及提取、衍生化、检测和/或定量来自样品的分析物的方法。本专利技术的方法采用通过固相提取(SPE)、化学衍生过程结合检测或定量感兴趣的分析物的样品清理(clean-up)过程以获得分析物特异性、稳健、快速、灵敏和准确的结果。感兴趣的分析物的衍生化将分析物从可能潜在地与样品中的其他生物试剂重叠的区域转移出去。因此，在检测过程中，通常会妨碍准确定量检测感兴趣的分析物的其它生物分子或污染物是在显著不同的光谱范围内检测(或者被完全洗脱)，允许精确定量感兴趣的分析物。这种分析物检测是有用的，例如在临床、兽医、法医和/或环境设定中。本专利技术的方法可包括感兴趣分析物的衍生化以及通过色谱和/或质谱中至少一种确定一种或多种分析物的量。在一个实施方式中，本专利技术的方法还包括从生物样品固相提取(SPE)分析物。在一个方面中，推荐使用基于阳离子交换的SPE来俘获含有胺的分析物。对于不含胺的分析物，采用基于反相二氧化硅吸附剂的SPE和蛋白碰撞，包括或不包括除去磷脂的过程，所述吸附剂可以是C4-C18烷基结合的二氧化硅，或者苯基结合的二氧化硅，或者联苯基结合的二氧化硅。在其他实施方式中，可使用具有高pH(8≤pH≤14)的最终洗脱缓冲液从阳离子交换固相洗脱含胺的分析物，任选地原位衍生化含胺的感兴趣的分析物，干净地制备用于检测和/或定量的分析物的衍生物。在另外的实施方式中，不含胺的分析物可通过非醇、水不混溶的有机溶剂(例如乙腈、DMF、丙酮、1,4-二噁烷、THF、NMP、DMSO等)从SPE吸附剂洗脱下来，然后在pH缓冲条件下直接衍生化分析物。在优选的实施方式中，用于检测含胺分析物的本专利技术方法包括阳离子交换SPE，从阳离子交换吸附剂洗脱高pH的含胺分析物，通过LC-MS/MS直接定量，或者原位衍生化，然后通过感兴趣分析物的LC-MS定量；允许生物样品在线转换成初步分析物提取以检测和/或定量。类似地，在检测含非胺的分析物的优选实施方式中，本专利技术的方法包括基于反相SPE，有机洗脱，然后在高pH缓冲条件下直接衍生化，然后通过LC-MSMS定量。或者，在另一实施方式中，可采用基于阴离子交换SPE检测具有羧基官能团的分析物，高pH洗脱缓冲液混合合适的有机溶剂如乙腈、DMF、丙酮、1,4-二噁烷、THF、NMP、DMSO等，接着分析物在pH缓冲条件下直接衍生化。还提供了用于检测和/或定量分析的试剂盒。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于确定测试样品中一种或多种分析物的存在的方法，所述方法包括：a)从所述测试样品固相提取一种或多种分析物，b)用具有碱性pH、或酸性pH、或中性pH的洗脱溶液从所述固相提取洗脱所述一种或多种分析物，c)用衍生化试剂原位衍生所述一种或多种分析物，和d)采用液相色谱和/或质谱检测所述一种或多种衍生化的分析物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.30 US 62/005,6761.一种用于确定测试样品中一种或多种分析物的存在的方法，所述方法包括：a)从所述测试样品固相提取一种或多种分析物，b)用具有碱性pH、或酸性pH、或中性pH的洗脱溶液从所述固相提取洗脱所述一种或多种分析物，c)用衍生化试剂原位衍生所述一种或多种分析物，和d)采用液相色谱和/或质谱检测所述一种或多种衍生化的分析物。2.一种用于确定样品中一种或多种分析物的量的方法，所述方法包括：在允许所述一种或多种分析物中至少一种衍生化的条件下，使用包含衍生化试剂的洗脱缓冲液将所述一种或多种分析物中至少一种从固相提取洗脱。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述一种或多种分析物是具有伯胺、仲胺或酚羟基的化合物。4.如权利要求3所述的方法，其中，所述一种或多种分析物是单胺神经递质，包括儿茶酚胺或其衍生物或代谢物之一，性激素或其衍生物或代谢物之一，大麻素或其衍生物或代谢物之一，甲状腺激素或其衍生物或代谢物之一，阿片试剂、阿片样物质或其衍生物或代谢物之一，或芳基环己胺或其衍生物或代谢物之一，安非他明或其衍生物或代谢物之一。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述样品是生物样品、土壤样品、或食物样品。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述衍生化试剂是酰卤。7.如权利要求6所述的方法，其中，所述酰卤是酰氯。8.如权利要求7所述的方法，其中，所述酰氯是式II的Fmoc氯化物：其中，R1,R2,R3和R4各自独立地是H，氟，氯，溴，碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，直链、支链或环状C1-8烷基，取代的乙烯基，或直链或支链或环状C1-8烷氧基。9.如权利要求8所述的方法，所述酰氯是以下化合物之一：其中，稠合环体系是全碳环或杂环芳香体系，任选地萘、喹诺酮、异喹啉、喹唑啉(quinzoline)、苯并呋喃、吲哚、苯并咪唑，具有5-7元取代或未取代的稠合环，或者非芳香性的碳环或杂环稠合环体系，例如3,4-二氢-1H-茚，或3,4-二氢-2H-色烯，具有4-8元稠合环，其中，所述稠合环适当时可以被一种或多种以下的取代基取代：卤素原子，任选地氟、氯、溴、或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，直链、支链或环状C1-8烷基，取代的乙烯基，或直链、支链或环状C1-8烷氧基。10.如权利要求7所述的方法，其中，所述酰氯是以下化合物之一：其中，R1和R2各自独立地是H，氟，氯，溴，碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，直链、支链或环状C1-8烷基，取代的乙烯基，或直链或支链或环状C1-8烷氧基。11.如权利要求10所述的方法，其中，所述酰氯是以下化合物之一：12.如权利要求7所述的方法，其中，所述酰氯是式II的化合物：其中，R1,R2,R3,R4和R5各自独立地是H，卤素原子如氟，氯，溴或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，直链、支链或环状C1-8烷基，取代的乙烯基，或直链或支链或环状C1-8烷氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄琦，菲利浦·A·迪姆逊，卡斯顿·R·力格曼，
申请(专利权)人：斯佩威尔股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US