作为蛋白质或核酸的输送载体的免疫共轭物制造技术

本发明专利技术提供了一种非病毒载体，它包含细胞结合组分，该组分具有与生物素标记的成分共轭的生物素结合因子。同时，还提供了一种将遗传物质导入特定细胞的方法，包括给人施用非病毒载体，其中所述的非病毒载体包含细胞结合组分，该组分具有与生物素标记的成分共轭的生物素结合因子。此外，还提供了一种向细胞送递细胞毒成分的方法，包括给人施用非病毒载体。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
专利
本专利技术主要涉及分子生物学和治疗学领域。具体地说，本专利技术涉及一种用于向细胞送递遗传信息的新的非病毒载体。现有技术目前，用于送递能够影响哺乳动物细胞分子特性的遗传物质的最常用机制是使用病毒，尤其是反转录病毒载体。但是，这种基因疗法或送递方式受到某些缺陷和潜在危险情况的影响。虽然反转录病毒已经比较常用，但现在正在对腺病毒进行研究，这两者都具有一定的潜力。不幸的是，病毒载体有许多缺点。首先，靶细胞如人细胞，必须能够通过表达一种特定的细胞表面成份与病毒相互作用，而这种特定成份在遗传信息送递的目标细胞或组织上可能不表达。其次，遗传物质必须在靶细胞如人细胞中整合和表达，这要求靶细胞正在活跃分裂，这种情况阻碍了送递系统的效率和均一性。即使整合成功，基因也可能不被宿主细胞内的机制所转录。第三，这种系统中允许的遗传信息大小是有限制的，必须进行极精确的设计以保证生物活性。第四，在基因疗法应用中必须使用复制缺陷型病毒以减少其与内源病毒重组成新的感染原的危险。复制缺陷型病毒可以减少但不能杜绝这种危险。第五，复制缺陷型病毒被设计成是非自动迁移的，所以需要重复注射来获取基因序列向全部细胞的成功送递。现有技术的缺陷在于缺乏非病毒载体。本专利技术满足本领域长期以来的这一需求与愿望。专利技术概述本专利技术特别提供了一种新的非病毒系统，用于送递能够改变有害或非期望表型特征的遗传物质。这样，在本专利技术的某实施例中提供了一种具有细胞结合组分的非病毒载体，该组分具有与生物素标记的成分共轭的生物素结合因子。在本专利技术的另一实施例中提供了一种将遗传物质导入特定细胞的方法，它包括给人施用非病毒载体，其中所述的非病毒载体包含具有与生物素标记的成分共轭的生物素结合因子的细胞结合组分。在本专利技术的另一实施例中，还提供了一种向细胞送递细胞毒成分的方法，包括给人施用非病毒载体。通过以下为揭示本
技术实现思路
而给出的对本专利技术优选实施例的说明，将会发现本专利技术的其它内容、特点和优点。附图简述以下附图是为了说明本专利技术各方面的内容。为此目的，有些图是示意形式的，没有必要按比例绘制。附图说明图1显示的是在G-25柱上从A108/SPDP中分离游离的SPDP。图2显示的是在G-25柱上从亲和素/2-IT中分离游离的2-IT。图3显示的是在S-200柱(FPLC)上从A108-亲和素共轭物中分离游离的亲和素。图4显示的是在Con-A柱上从A108-亲和素共轭物中分离游离的抗体。图5显示的是显示A108-亲和素共轭物纯化步骤的7.5％SDS-PAGE小凝胶。图6显示的是生物素标记的白树毒素分析中的结合活性。图7显示的是G-75柱上(FPLC)A108-亲和素白树毒素/生物素共轭物和游离的亲和素白树毒素与部分亲和素亚基分离的情况。图8显示的是对生物素标记的白树毒素和对A108-亲和素生物素标记的白树毒素共轭物的Elisa结合活性分析。图9显示的是与A108-亲和素生物素标记的白树毒素共轭物相比，A108-白树毒素共轭物对A431细胞的细胞毒性。图10显示的是将细胞与定向针对EGF受体基因启动子序列的核苷酸序列(标记为反义EGFr)培养的结果。详细说明本专利技术提供了一种非病毒载体，它包含细胞结合组分，该组份具有与生物素标记的成分共轭的生物素结合因子。一般说来，本专利技术的生物素结合因子是可与生物素结合并易于被本领域一般技术人员识别的任何化学物质。较好的是，生物素结合因子选自亲和素，链霉亲和素或它们的类似物。本专利技术的细胞结合因子可以是几种实施例中的一种。例如，细胞结合因子可以是单克隆抗体。用于本专利技术组合物和方法中的单克隆抗体与某抗原特异性地结合。与抗体结合的抗原的代表性实例有表皮生长因子受体、c-erbB2抗原、Lewis Y抗原、运铁蛋白受体、MDR1、MDR3、胰岛素受体、CD45、CD33、GP240、GD2、GD3、成纤维细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子受体。或者，细胞结合因子是一种配体，与一种细胞表面受体特异性结合。结合细胞表面受体的配体的代表性实例有转化生长因子-α、heregulin、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子受体。一般来说，生物素标记的成分可以是能够适当地被生物素标记的任何化合物，而且是人们期望的特异性地导入细胞以产生特定生物学或药理学作用的化学物质。因此，生物素标记的成分可以是某种蛋白质或核酸。用于本专利技术组合物和方法中的蛋白质的代表性实例有白树毒素、蓖麻毒蛋白、皂草素、红豆毒蛋白、白喉毒素、假单孢菌外毒素、rayalase、超氧化物歧化酶、酪氨酸蛋白磷酸酶、蛋白磷酸酶(PP-1或PP-2)、蛋白激酶A和蛋白激酶C。核酸的代表性实例有三股螺旋寡聚核苷酸如三螺旋EGF受体寡聚核苷酸、反义寡聚核苷酸如EGF或myc的、部分基因序列如编码有几个结构域蛋白质(如c-src或EGF受体)的单个结构域的序列以及完整基因即取自反转录病毒基因组的一个整合单元。本专利技术还提供了一种将遗传物质导入特定细胞的方法，包括给人施用非病毒载体，其中所述的非病毒载体包含细胞结合组分，该组份具有与生物素标记的成分共轭的生物素结合因子。本专利技术还提供了一种向细胞送递细胞毒成分的方法，包括给人施用非病毒载体。本专利技术涉及组合物和方法，它们允许不使用病毒感染或转染成份而将核酸导入特定的细胞集合。定向针对某种细胞表面成份的单克隆抗体被修饰并用于向胞内携带核酸，该核酸能够改变基因的表达、特异性地提高或降低靶细胞内被表达的蛋白质的水平。本专利技术可应用于人体的反义核酸技术中。用生物素结合成分与核酸序列修饰定向针对细胞表面成份的单克隆抗体，该核酸与基因组DNA或mRNA结合从而改变基因表达，并使用核酸序列的生物素标记的衍生物通过亲和素生物素相互作用进行连接。通过抗体抗原复合物的内化作用，活性核酸序列被同时内化，提高了这些序列在细胞内的浓度。本专利技术的用途在于(1)利用不同于病毒载体相关机制的或不同于通过细胞膜的简单或帮助扩散的机制来提高基因表达调控的核酸序列的胞内浓度；(2)因为不需要以通过细胞膜的简单扩散作为这些序列进入细胞的机制，克服了小分子(即活性核酸序列(-20-聚体))的限制；(3)通过抗体抗原相互作用而不是通过通用的送递或病毒感染来特异性地或选择性地送递目标序列，从而提高有效核酸序列的胞内浓度。在本专利技术的一个实施例中，合成一段针对致癌蛋白质的反义DNA，其横跨mRNA转译起始密码子的上游和下游的多个核苷酸(10)。然后，合成一段与以上合成的反义DNA的头5个核苷酸互补的DNA。然后，将生物素-核苷酸成分掺入该序列中。将两链杂交，然后通过肿瘤定向的MAb亲和素/链霉亲和素使之送递入肿瘤。以下实施例只是为了说明本专利技术的各种实施方法，并不以任何方式限制本专利技术的范围。实施例1抗体A108的修饰A108识别人表皮生长因子受体。在一支12×75mm玻璃试管中加入10mg溶于2.2ml磷酸盐缓冲液中的A108。取9.35μl抗体和2.5倍摩尔数过量的SPDP(3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀酰亚胺酯)缓慢加入试管，同时涡流搅拌，SPDP取自3mg/ml的二甲基甲酰胺溶液。室温下培养30分钟，期间每5分钟涡流搅拌一次。在Sephadex G-25柱(1.5×37cm)上利用凝胶过滤色谱去除未反应的过量SPDP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非病毒载体，其特征在于，它包含细胞结合组分，该组分具有与生物素标记的成分共轭的生物素结合因子。２．根据权利要求１所述的非病毒载体，其特征在于，其中所述的生物素结合因子选自亲和素、链霉亲和素或亲和素或链霉亲和素的类似物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MG罗森布拉姆，NJ多纳托，
申请(专利权)人：研究发展基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]