具有促进生长特性的肽制造技术

肽，包含氨基酸序列Ｘａａ－Ｘａａ－Ｌｅｕ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｉｌｅ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｌｅｕ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｖａｌ－Ｘａａ－Ｘａａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１），其特征在于，所述序列不同于猪生长激素（ｐＳＴ）的天然序列。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及可诱出能提高猪生长激素活性和促进温血动物生长的抗体的肽。技术背景猪生长激素(pST)是长度为191个氨基酸的垂体激素，它具有多种生物活性(文献条目1)。该激素是以4个反向平行α-螺旋排列的单链多肽的形式存在(2)。各α-螺旋含3.6个氨基酸/回转。该周期性在螺旋的同一面每隔3或4个残基出现。对家畜施用pST可促进其肌肉生长、提高饲料效率，并可减少脂肪积累(3，4)。pST的内生量小，因此，人们将努力方向集中在外源性pST的制备上，以在农业上大规模使用。但在配制和施用上的困难业已影响了外源性pST的广泛使用。长期注入要求pST分子具有稳定性且pST能在一段时间内可控释放。此外，每日或经常地定期注射pST需要人工成本，从而使pST的长处变得不经济。人们已在减少这些困难上作了一些努力，包括添加可加强pST活性的成分来降低pST的需要量。已有报道说，与生长激素配合的单克隆和多克隆抗体可进一步提高生长激素在体内的生物活性(5-9)。虽然由抗体介异的生长促进的机理尚不完全清楚，但已有人提出用生长激素的药理动力学和/或生物分布的变化来部分解释生长促进现象(10)。还有人提出，促进是由于抗体对生长激素受体亚类的结合的选择性调节所致(5，6，11，12)。还有报道说，生长激素对肝躯体原受体的结合的改善是一种可能的解释(13)。值得注意的是，这些抗体在缺乏外源性pST时其自身并不促进生长。用免疫学方法促进动物生长的一个尝试已产生出标号为PS-7.6的单克隆抗体，该抗体在被切除垂体的大鼠测定中始终如一地提高pST生物活性(10)，虽然在缺乏pST时，其自身并不促进生长。然而，由于抗体的多次用药所需的单克隆抗体和人工的成本，用该促进生长的单克隆抗体对家畜进行被动免疫在经济上不是最合适的。因此，需要对促进生长进行新的探索，以减少目前方案中所遇到的困难。这些探索中的一个是设计模拟与PS-7.6单克隆抗体结合的pST区域的肽。用与可被PS-7.6单克隆抗体识别的表位一致的肽片段对动物进行主动免疫将产生与提高内源性pST活性的PS-7.6单克隆抗体在功能上类似的抗体。因此，鉴定可被PS-7.6单克隆抗体识别的表位对设计可改善动物生长状况的肽类疫苗而言是关键的。大多数肽具有天然蛋白质的一级构象，但缺少二级构象。在溶液中，短肽的结构一般快速地互相转换(随机螺旋)。与pST的所需区域类似的构象将仅在小部分的肽中存在一定的时间。因此，需要设计具有确定的二级构象的肽。专利技术的概述因而，本专利技术的一个目的是设计具有明确的二级结构，最好是具有模拟pST对应区域的螺旋构象的肽。本专利技术的另一目的是设计与pST竞争同PS-7.6单克隆抗体结合的肽。本专利技术的又一目的是开发使用这些肽以促进温血动物生长的组合物。本专利技术的这些目的通过含氨基酸序列Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Val-Xaa-Xaa(SEQ ID NO1)的肽来完成的，所述序列不同于pST的天然序列。本专利技术还包括SEQ ID NO1的第一个或第二个亮氨酸或缬氨酸中的一个或多个被正(直链)亮氨酸(Nle)置换的肽。本专利技术还涉及必需氨基酸的位置移动了几乎表示沿螺旋一个回转的3个氨基酸的肽，该肽含氨基酸序列Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Val(SEQ IDNO18)，所述序列不同于pST的天然序列。通过限定第3个氨基酸残基为异亮氨酸来进一步修饰SEQ ID NO18的肽，产生氨基酸序列Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Val(SEQ ID NO19)，所述序列不同于pST的天然序列。这些肽最好含作为螺旋构象促进剂的丝氨酸，在所述螺旋构象中，丝氨酸为紧靠SEQ ID NO1中第一个亮氨酸的氨基末端的氨基酸和紧靠SEQ ID NO19中第一个异亮氨酸的氨基末端的氨基酸。将本专利技术的肽与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体合用，配制促进温血动物生长的组合物。附图的简单说明附图说明图1描述胰蛋白酶消化物(泳道1)、组分#9(泳道2)和#9-5(泳道3)，它们与PS-7.6单克隆抗体一起温育、用磁化的山羊抗小鼠IgG抗体免疫沉淀、经过SDS-PAGE电泳、电印迹在PVDF膜上、用兔抗pST多克隆抗体探测、接着用碘化的驴抗兔IgG抗体探测、最后在X射线胶片和放射自显影图上显影。图2描述肽pST(70-95)、pST(64-95)和pST(54-95)(图2A)、以及pST(75-95)和pST(75-90)(图2B)，它们是通过合成制得的，并通过竞争性放射免疫测定法(RIA)就它们对PS-7.6单克隆抗体与125I-pST之间相互作用的抑制效果进行测试。还对非标记的完整的pST进行测试并用作阳性对照。图3描述放射免疫测定的结果，该测定测试与放射性标记的pST竞争同PS-7.6单克隆抗体的结合，比较物为(1)pGH(75-95)肽，(2)pGH(80-90)肽，和(3)pGH(81-90)肽。图4描述pST(75-95)片段的氨基酸，其中的氨基酸残基75-90被丙氨酸依序取代。用竞争性RIA测试这些类似物。从5个独立的实验对各残基的有效竞争的IC50进行平均。图5描述pST的pST(75-95)的螺旋投射。有阴影的圈是对被PS-7.6单克隆抗体识别而言关键的氨基酸。图6描述放射免疫测定的结果，该测定测试与放射性标记的pST竞争同PS-7.6单克隆抗体的结合，比较物为(1)与pST的氨基酸75-95的天然序列一致的肽(称作图5中的“pGH(75-95)”)，(2)SEQ ID NO2的肽(称作“肽-X”)，和(3)，其中的氨基末端的氨基通过添加乙酰基而被修饰的肽-X的修饰型(称作“加帽的肽-X”)。图7描述放射免疫测定的结果，该测定测试与放射性标记的pST竞争同PS-7.6单克隆抗体的结合，比较物为(1)pGH(75-95)肽，和(2)不在本专利技术范围内的SEQ ID NO21的肽(称作图6中的“肽-Y”)。图8描述放射免疫测定的结果，该测定测试与放射性标记的pST(称作图5中的“pGH”)竞争同PS-7.6单克隆抗体的结合，比较物为(1)pGH(75-95)肽，(2)肽-X，(3)肽-Y，和(4)第一个亮氨酸被正亮氨酸(Nle)置换，产生SEQID NO13的肽-X(称作图7中的“Nle80”)，(5)第二个亮氨酸被正亮氨酸(Nle)置换，产生SEQ ID NO14的肽-X(称作“Nle87”)，和(6)缬氨酸被正亮氨酸(Nle)置换，产生SEQ ID NO15的肽-X(称作“Nle90”)。图9描述未进行处理(阴性对照，第一条)；用pST单独处理(阳性对照，第二条)；用pST处理且在用由3种不同的小猪制得的肽-X进行免疫之前和之后用猪抗体进行处理(3组大鼠，第3-8条)对被切除垂体的大鼠生长的影响。专利技术的详细描述本专利技术包含模拟pST螺旋区域的肽的设计。这些肽具有与pST的最小序列同源性以使肽能保持螺旋构造。这些肽模拟物诱出可识别天然pST本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：B·L·巴克沃尔特，HM·希赫，B·S·旺，
申请(专利权)人：美国氰胺公司，
类型：发明
国别省市：