基于水蛭素氨基酸序列的凝血酶抑制剂制造技术

肽衍生物（Ⅰ）： （Ｄ）－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－（ＣＨ↓［２］）↓［４］（ＣＯ）－［ＮＨ（ＣＨ↓［２］）↓［４］ＣＯ］↓［２］－ＤＦＥＰＩＰＬ及其药物上可接受的盐。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用作凝血酶抑制剂的肽衍生物，具体涉及基于含氨基酸45-65的水蛭素片段序列的肽衍生物。凝血酶是凝血级联系统的一种重要的丝氨酸蛋白酶组分。除了分裂血纤蛋白原而引发血液凝固之外，凝血酶还激活其它凝血剂因子，包括凝血因子V、VIII和XIII，并激活抗凝血酶蛋白C。凝血酶也是一种有效的血小板激活物，它可减少活体内由组织纤溶酶原激活物介导的血栓溶解。所以，凝血酶的正反馈调节起增强止血作用，但引起血管畸变和脑血管动脉畸变而导致形成危及生命的血栓。已知该酶有多种功能，它若被有效的专一性化合物抑制，则会对血栓形成相关疾病的治疗起不可估量的作用。这类疾病包括冠状动脉疾病、脑血管疾病、末梢动脉堵塞疾病、深处静脉血栓形成和肺栓塞。已知最有效的凝血酶抑制剂是水蛭素，它是一类从医用水蛭这种水蛭的腺分泌物中分离而得的同工蛋白质。很久以前人们就知道水蛭素的抗凝血性能。然而，迄今为止其治疗价值很小，因为其肠内吸收和皮肤吸收均相当少，故难于将该蛋白质配制成易于生效和易于施药的形式，因此该蛋白质不可能在血流中形成适当的浓度。此外，不可能临床应用从水蛭提取物中分离的水蛭素，这是由于受其有限质量、费用和变应性反应的限制，其中的变应性反应系施药水蛭素大小的外源蛋白质时会经常出现的反应。在其题为“Pharmacology of selective thrombin inhibitors”，(1988)，Nouv.Rev.Fr.Hematol.30，pp.161-165的出版物中，Markwardt基于对天然的和合成的凝血酶抑制剂的药理研究结果而进一步提供有关水蛭素的临床资料。该作者对水蛭素作了全面实验，指出含强酸性C端部分的肽对α-凝血酶有高度专一性。然后他推断出水蛭素的C端部分有可能结合到该酶的阴离子结合位点区，而其致密的N端部分似乎结合到该酶的活性中心区。业已发现，天然的脱硫水蛭素45-65以剂量相关的方式抑制牛α-凝血酶和人α-凝血酶引起的血纤蛋白原凝血。牛α-凝血酶的IC50值为940±200nM，它与有关同样片段形成血浆血纤蛋白血块的报道值相当吻合，且比水蛭素55-65低3倍，后者被指定为抗凝血活性所要求的极限核心(minimum core)。还有人证实此肽抗人α-凝血酶比抗牛α-凝血酶始终更为有效。各种现有技术文献也阐述了，水蛭素氨基酸序列的活性片段好象是包括氨基酸46-65的氨基酸序列。于是，人们试图通过取代该序列中的某些氨基酸以增强此肽的抑制活性。Krstenansky等人在“Antithrombin properties of C-terminus ofhirudin using synthetic unsulfated Nα-acetyl-hirudin”，(1987)，FebsLetters，Vol.211，No.1，pp.10-16中描述了未脱硫Nα-乙酰基水蛭素45-65的C端片段的合成。作者们参照先前的工作(Chang，J.-V.，FEBS Letters，164，307(1983))并提到该片段可能含两个专一性结合区，一个结合到凝血酶的催化位点，而另一个结合到凝血酶的另一识别位点。两组作者也推断事实并非如此。作者们还是阐明了水蛭素的45-65序列具有抑制凝血活性和凝血酶释放血纤肽A的能力。他们还提议，水蛭素45-65的同样序列可能不直接参与同凝血酶的催化位点的结合，因为凝血酶对合成底物的酰胺分解性能未受干扰。在Krstenansky等人的标题为“Anticoagulant peptidesnature ofthe interaction of the C-terminal region of hirudin with a noncatalytic siteon thrombin”，(1987)，J.Med.chem.，30，pp.1688-1691的论文中，作者们报道了在凝血酶的非催化结合位点处最小活性序列是水蛭素56-64。作者们基于这一设想报道了几种C端水蛭素54-65类似物的合成及其抑制凝血酶引起的形成血纤蛋白凝血的能力，目的在于确定水蛭素56-64和凝血酶的非催化结合位点之间的性质。在结论中，作者们提到水蛭素的C端区可能结合到与凝血酶连接的纤维蛋白原区，它不是迄今文献中提出的区。在下列文献中Dodt等人(Interaction of site specific hirudinvariants withα-thrombin，(1988)，Febs Letters，Vol.229，No.1，pp.87-90)，Degryse等人(Point mutations modifying the thrombin inhibitionkinetics and antithrombotic activity in vi vo of recombinant hirudin，(1989)，Protein Engineering，Vol.2，No.6，pp.459-465)和Braun等人(Use of site-directed mutagenesis to investigate the basis for the specificityof hirudin，(1988)，Biochemistry，27，pp.6517-6522)，作者们报道了在水蛭素基因上进行的定位诱变结果，研究了突变体水蛭素肽对凝血酶的抑制作用。在这些出版物中，作者们研究了在整个蛋白质进行的突变且其自身并不限制于水蛭素的45-65片段。此外，对45-65片段进行的修饰均局限于单个修饰，常在47号位置，虽然这些出版物还显示了在位置51、57、58、61和62处的突变，但它说明该残基不与活性中心相互作用。Dodt等人以类似方式在论文“Distinct binding sites of Ala48-Hirudin1-47and Ala48-Hirudin48-65on α-thrombin”，(1990)，The Journal ofBiological Chemistry，Vol.265，No.2，pp.713-718中描述了一些实验，旨在进行在水蛭素序列48号位置上的定位诱变。Dodt等人在此处所做的工作似乎被局限于在该位置上用脯氨酸取代丙氨酸，以促进他们的实验中所需的蛋白酶解。最后，Maraganore等人，在“Anticoagulant activity of synthetichirudin peptides”，(1989)，The Journal of Biological Chemistry，Vol.264，No.15，pp.8692-8698中，Dennis等人在“Use of fragments of hirudinto investigate thrombin-hirudin interaction”，(1990)，Eur.J.Biochem.188，pp.61-66中，以及Chang等人在“The structural elements ofhirudin which bind to the fibrinogen recognition site of thrombin areexclusively 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：J·迪迈奥，
申请(专利权)人：加拿大国家研究委员会，
类型：发明
国别省市：